Probiotics làm tăng quá trình hấp thu chất  dinh  dưỡng; ức chế vi sinh vật gây bệnh; tăng cuờng hệ thống miễn dịch; cân bằng khu hệ vi sinh vật trong đường tiêu hoá; probiotics không mang mầm bệnh và chất độc hại. Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) là một trong những loại  nấm men có nhiều protein có giá trị sinh vật học, giàu vitamin nhóm B, nhiều khoáng chất quan trọng, làm tăng khả năng tích lũy phốt pho, giảm các trường hợp nhiễm bệnh, tăng  khả năng sinh trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn. S. cerevisiae được coi là một trong những vi sinh vật sống mà khi sử dụng qua đường tiêu hóa nó có tác động tích cực đến sức khỏe vật chủ thông qua các hiệu ứng dinh dưỡng trực tiếp của nó.

Chủng nấm men S.cerevisiae dùng làm probiotics để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi phải chịu được các bất lợi trong đường tiêu hoá như chịu nhiệt, chịu pH thấp, muối mật cao…; phát triển và cạnh tranh vị trí bám và chất dinh dưỡng với các vi khuẩn có hại trong đường tiêu hoá. S. cerevisiae là loại nấm men sử dụng trong chăn nuôi rất phổ biến  trên thị trường. Tuy nhiên, ảnh  hưởng  của  các chủng nấm men khác nhau đối với động vật là khác nhau đáng kể và chủng nấm men phân lập từ hệ tiêu hóa động vật là thích nghi với môi trường đường  tiêu  hóa và mang nhiều đặc tính có thể được sử dụng sản xuất probiotics.

Vì vậy, mục đích của nghiên cứu này là phân lập và định danh một số chủng nấm men S. cerevisiae từ chất chứa trong ruột gà và đánh giá sự phù hợp để sản xuất chế phẩm probiotics sử dụng trong chăn nuôi.

1. Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu chất chứa được lấy từ đường tiêu hoá (ruột) gà trưởng thành khoẻ mạnh không được sử dụng men tiêu hoá từ trại gà tại thành phố Huế.

Môi trường: yeast peptone dextrose (YPD), Christensen, muối mật và một số hoá chất  được mua từ hãng HiMedia (Ấn Độ), chloramphenicol mua từ công ty Nam Khoa (Việt Nam).

2. Phương pháp nghiên cứu

2.1. Phương pháp phân lập nấm men

Phương pháp phân lập nấm men được thực hiện, theo đó: các chất chứa từ đường tiêu hoá  (ruột) của gà được cho vào túi đựng mẫu đã tiệt trùng, bảo quản lạnh đưa về phòng thí nghiệm, mẫu được pha loãng 10 lần trong nước muối sinh lý vô trùng (0,85% NaCl) (tỷ  lệ 1:9) và để ở nhiệt độ phòng (25⁰C) khoảng 90 phút. Lấy 1 mL các dung dịch pha loãng cấy trải (làm hai lần) trên môi trường thạch đĩa yeast peptone dextrose (YPD) có bổ sung kháng  sinh chloramphenicol (200 mg/L) sau đó ủ ở 30⁰C. Sau khi ủ 48 giờ chọn các  khuẩn lạc riêng lẻ, có màu trắng, rìa tròn đều, trơn nhẵn, dạng mô nổi cấy thuần lại trên môi trường thạch đĩa YPD và bảo quản ở nhiệt độ 4⁰C.

2.2. Phương pháp xác định đặc điểm hình thái, sinh hoá và định danh nấm men

Các đặc điểm về hình thái và sinh hóa cơ bản của nấm men như hình dạng và kích thước tế bào nấm men, khả năng lên men đường, hoạt tính phân giải urea được thực  hiện và phân loại sơ bộ.  Trên  môi  trường  thạch  đĩa  YPD chọn  những  khuẩn  lạc  nấm  men  có  màu trắng, rìa tròn đều, trơn nhẵn, dạng mô nổi làm tiêu bản nhuộm quan sát dưới kính hiển vi  (sử dụng vật kính x100) thấy có hình oval, hình cầu, hình elip và nảy chồi; khả năng lên men đường được thử nghiệm trên các loại đường glucose, saccharose, maltose, galactose, lactose (2%) trong  ống nghiệm 15 mL có chuông Durham. Sự thay đổi màu của môi trường Christensen khi thửnghiệm nấm men phân lập sau thời gian ủ 7 ngày thể  hiện hoạt tính phân giải urea của các chủng nấm men.

Xác định trình tự gen để định danh nấm  men: Các chủng nấm men đã được phân loại sơ bộ ở trên sẽ được tiến hành định danh bằng phương pháp sử  dụng cặp mồi ITS1 và ITS4 để  khuếch đại khu vực ITS trong các mẫu DNA của nấm, giải trình tự  bằng  phương  pháp

Sanger và BLAST đối chiếu trên NCBI do công ty TNHH T&N BIOSOLUTION thực hiện.

2.3.  Phương pháp đánh giá đặc tính probioticss của các chủng nấm men

Các chủng S. cerevisiae được sử dụng để đánh giá đặc tính probioticss ở điều kiện  phòng thí nghiệm. Dịch nấm men lỏng được chuẩn bị có giá trị OD₆₀₀ là 1,0 tương đương khoảng 107(CFU/mL). Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, bao gồm :

Đánh  giá  khả  năng  chịu  nhiệt: Dịch nấm men được cấy trong môi trường YPD lỏng vô trùng với tỷ lệ 1%  (v/v) sau đó được ủ ở các mức nhiệt độ khác nhau 30⁰C, 37⁰C, 42⁰C và 50⁰C. Sau 24 giờ xác định số lượng tế bào sống bằng phương pháp đếm gián tiếp thông qua khuẩn lạc mọc trên thạch đĩa YPD.

Đánh giá khả năng sinh trưởng trong môi trường có pH thấp: 1% dịch nấm men cũng được nuôi ở 30⁰C trong môi trường lỏng YPD vô trùng có pH khác nhau (2 ; 3 ; 4 và 5,5) được điều chỉnh bằng acidHCl 1M. Sau 24 giờ xác định số lượng tế bào sống bằng phương pháp đếm gián tiếp thông qua khuẩn lạc mọc trên thạch đĩa YPD.

Đánh giá khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối mật khác nhau: 1% dịch nấm men được nuôi ở 30⁰C trong môi trường YPD lỏng vô trùng có các nồng độ muối mật khác nhau (0,1%, 0,2%, 0,3%). Sau 24 giờ xác định số lượng tế bào sống bằng phương pháp đếm  gián tiếp thông qua khuẩn lạc mọc trên thạch đĩa YPD.

2.4. Phương pháp xử lý và phân tích số liệu

Số liệu thu được được tổng hợp, xử lý và phân tích sơ bộ ban đầu bằng MS. Excel 2018, sau đó được phân tích sâu bằng phần mềm IBM SPSS 20. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp thống kê mô tả thông qua giá trị trung bình. Ngoài ra, nghiên cứu này còn sử dụng kiểm định ANOVA để kiểm  định  sự  khác  biệt  giá  trị  trung  bình giữa 3 chủng nghiên cứu.Trong đó, các giá trị trung bình trong cùng một cột có chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

3. Kết luận

Kết quả của nghiên cứu này đã phân lập được 32 chủng nấm men từ  chất chứa trong ruột gà, trong đó 3 chủng (Y100, Y63, Y35) là loài S. cerevisiae. Ba chủng nấm men này đã được sàng lọc về khả năng chịunhiệt độ cao, pH thấp, muối mật ở điều kiện phòng  thí nghiệm. Kết quả thu được cho thấy chủng Y35, Y100 cho sinh khối cao hơn ở các điều kiện thử nghiệm và có thể là probiotics tiềm năng. Vì vậy, có thể sử dụng 2 chủng  S.cerevisiae Y35, Y100 để đánh giá thêm các tiêu chí khác cho mục đích sản xuất probiotics dùng trong chăn nuôi.