Tuy nhiên, các kỹ thuật được sử dụng để cố định kháng thể như hấp thụ thụ động, cố định thông qua liên kết cộng hóa trị và liên kết ái lực chưa thực sự hiệu quả do còn tồn đọng nhiều nhược điểm như: sự gắn kết ngẫu nhiên trên của kháng thể, thời gian bảo quản, hiệu suất, cần can thiệp đến cấu trúc của kháng thể, đặc biệt là chi phí sản xuất cao. Vì vậy, trong nghiên cứu này, protein PS-Ax1 đóng vai trò như protein cầu nối giúp định hướng kháng thể trên bề mặt polystyrene và bước đầu xác nhận khả năng tương tác của protein mục tiêu với bề mặt vật liệu polystyrene. Kết quả này tạo tiền đề cho việc nghiên cứu phát triển các kit xét nghiệm miễn dịch khác.

Các kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sử dụng pha rắn (Solid-phase Immunosorbent Tests – SPITs) ra đời mang lại tiềm năng lớn trong việc phát hiện bệnh trên người và động vật. Các kỹ thuật SPIT thông dụng có thể kể đến như: ELISA, xét nghiệm ngưng kết huyết thanh, xét nghiệm dòng chảy bên, … Bước đầu để thiết kế cũng như phát triển các kỹ thuật trên là dựa trên sự tương tác đặc hiệu giữa các kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên đó được cố định trên pha rắn. Với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học, chúng ta đã có thể chủ động thu nhận được nhiều loại kháng thể, cả đơn dòng và đa dòng, thông qua nhiều hệ thống thu nhận như chuột, thỏ (Weber et al., 2017). Đặc biệt, với công nghệ protein tái tổ hợp, nhiều loại kháng thể đã được cải biến, như kháng thể chuỗi đơn scFv, mảnh kháng thể Fab,… để phù hợp với nhiều mục đích sử dụng khác nhau (Kumuda, 2014). Bên cạnh đó, việc cải biến và sản xuất các kháng thể tái tổ hợp thông qua các hệ thống biểu hiện như E. coli, nấm men giúp giảm thiểu giá thành sản phẩm và thời gian sản xuất (Verma et al., 1998). Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật xét nghiệm dựa trên pha rắn phụ thuộc lớn vào loại pha rắn, loại kháng thể, cơ chất phản ứng và đặc biệt là sự định hướng của kháng thể bề mặt vật liệu, thông thường là polystyrene. Nhìn chung, khả năng liên kết kháng nguyên của kháng thể phụ thuộc chủ yếu vào cấu trạng của chúng sau khi được gắn lên pha rắn với ba cấu trạng chính: i) ends-on (đuôi Fc gắn với bề mặt vật liệu); ii) side[1]on (các mặt bên của kháng thể gắn với bề mặt vật liệu); và iii) top-on (vùng Fab của kháng thể gắn với bề mặt vật liệu).

Hiện nay, các chiến lược cố định kháng thể lên pha rắn thường được sử dụng: hấp thụ thụ động, cố định bằng liên kết cộng hóa trị và liên kết ái lực. Đầu tiên, hấp thụ thụ động cho thấy hiệu quả cao khi tận dụng các đặc tính của kháng thể - vùng Fc mang tính kỵ nước có kích thước lớn - giúp chúng có thể dễ dàng cố định lên trên bề mặt vật liệu polystyrene thông qua tương tác kỵ nước (Norde & Lyklema, 1978). Tuy nhiên, đây là kỹ thuật cố định kháng thể một cách ngẫu nhiên, dẫn đến việc kháng thể được cố định sẽ mang nhiều cấu trạng khác nhau, dẫn đến giảm thiểu độ nhạy của xét nghiệm do không xoay định hướng vùng Fab liên kết kháng nguyên hoặc vùng Fab này bị che phủ do tạo nên sự đa lớp kháng thể trên bề mặt hạt (Jódar-Reyes et al., 2005). Một nhược điểm đáng chú ý khác là việc hấp thụ thụ động chỉ giúp cố định kháng thể lên bề mặt vật liệu trong một thời gian ngắn và có thể mất sự cố định dưới tác động của các lực vật lý (Ortega-Vinuesa et al., 1996). Do đó, cố định kháng thể bằng liên kết cộng hóa trị là giải pháp thay thế để giải quyết vấn đề trên. Tuy nhiên, việc tạo liên kết hóa học giữa bề mặt vật liệu với kháng thể có bản chất là protein thông qua các linker hóa học có thể gây ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc và chức năng của kháng thể, cũng như hiệu suất thấp do các gốc phản ứng có khả năng tạo liên kết trên bề mặt vật liệu, đơn cử là hạt latex chỉ chiếm ~10% so với tổng diện tích bề mặt (Chan et al., 2007). Việc cố định thông qua liên kết cộng hóa trị cũng làm tăng giá thành sản phẩm cũng như quy trình thực hiện phức tạp do cần phải xử lý hạt để loại bỏ các linker và gốc hóa học trên bề mặt chưa được liên kết với kháng thể. Cuối cùng, liên kết kháng thể với bề mặt hạt latex thông qua liên kết ái lực giữa Biotin-Streptavidin cho thấy hiệu quả cao hơn hẳn hai kỹ thuật trên. Mặc dù phương pháp này có khả năng định hướng kháng thể cao cũng như liên kết bền vững nhưng việc tiền xử lý kháng thể yêu cầu kỹ thuật phức tạp, giá thành cao cũng như gây ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của kháng thể (Chivers et al., 2011).

Vì vậy, trong bài viết này, thiết kế một protein dung hợp giữa tiểu phần protein A và đuôi peptide có ái lực cao với bề mặt vật liệu polystyrene đã được nghiên cứu. Protein Ax1 được thu nhận từ vi khuẩn Staphylococcus aureus có khả năng liên kết đặc hiệu với đuôi Fc của kháng thể qua đó giúp xoay định hướng vùng Fab ra ngoài bề mặt vật liệu; trong khi đó, đuôi peptide có ái lực cao với bề mặt vật liệu polystyrene giúp protein dung hợp có thể năng liên kết chặt chẽ với vật liệu polystyrene (Tang et al., 2003; Kumada et al., 2021). Việc phủ bề mặt vật liệu bằng protein dung hợp PS-Ax1 cho thấy tiềm năng cao trong việc giải quyết các vất đề còn tồn đọng trong SPITs. Bên cạnh đó, nghiên cứu này cũng bước đầu xác định khả năng liên kết với polystyrene của protein dung hợp.

nqhuy