Các phần mềm tin sinh học thiết kế 2 gRNA được sử dụng và tạo dòng được plasmid px330-gRNA-R và px330-gRNA-L có khả năng định hướng giúp hệ CRISPR/Cas9 loại bỏ đoạn exon 3 có chiều dài 420bp, ở vị trí 29070816 – 29071236 trên gene Lep. Phôi chuột được tạo ra bằng phương pháp bơm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI). Sau 6 h ICSI (Intra-Cytoplasmic Sperm Injection), phôi chuột ở giai đoạn hợp tử hai tiền nhân, được knockout gene bằng cách vi tiêm plasmid px330- gRNA-R và px330-gRNA-L với nồng độ 5 ng/µl vào tiền nhân đực. Kết quả kiểm tra PCR các phôi có vi tiêm plasmid cho thấy 36/72 (50%) phôi đã được loại bỏ đoạn exon 3 gene Lep. Như vậy, nghiên cứu đã tạo thành công phôi knockout gene Lep ở dạng dị hợp.

Ở Việt nam, việc tạo động vật chuyển gene vẫn còn là vấn đề mới. Hiện tại, vẫn chưa có công bố về các nghiên cứu biến đổi di truyền trên chuột - mô hình động vật để nghiên cứu các bệnh lý trên người. Chuột knockout có hữu ích trong việc nghiên cứu và mô hình hóa các loại bệnh khác nhau như ung thư, béo phì, bệnh tim, đái tháo đường, viêm khớp, stress, lão hóa và bệnh Parkinson. Chuột knockout cũng cung cấp một bối cảnh sinh học trong đó thuốc và các liệu pháp khác có thể được phát triển và thử nghiệm (Rajashekar et al., 2013). Do đó, việc chủ được công nghệ tạo chuột biến đổi di truyền sẽ hỗ trợ rất lớn cho các nghiên cứu y sinh phục vụ nâng cao chất lượng cuộc sống con người.

Động vật biến đổi gene thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm như một mô hình trong nghiên cứu y sinh. Chúng là những công cụ quan trọng để nghiên cứu bệnh ở người, được sử dụng để tìm hiểu chức năng gene trong từng bệnh cụ thể, tiến trình phát triển và xác định các đáp ứng với can thiệp điều trị. Hơn 95% trong số đó được sử dụng là loài gặm nhấm biến đổi gene, chủ yếu là chuột. Để tạo mô hình động vật bị biến đổi gene, ta có thể sử dụng phương pháp chuyển gene loại bỏ hoặc khoá gene nào đó để xác định chức năng của gene. Sự phát triển của động vật chuyển gene gần đây có nhiều thay đổi nhờ sự xuất hiện của công cụ chỉnh sửa gene mới CRISPR, giúp giảm đáng kể số bước để tạo động vật chuyển gene, làm cho toàn bộ quá trình nhanh hơn và ít tốn kém hơn (Wang et al., 2019). CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) là một hệ thống miễn dịch thích nghi, tồn tại trong nhiều loại vi khuẩn. Việc ứng dụng CRISPR/Cas 9 trong nghiên cứu sản xuất động vật biến đổi di truyền giúp tạo các sinh vật mô hình một cách nhanh chóng, hiệu quả và tiết kiệm chi phí (Zhang et al., 2017). Công nghệ CRISPR/Cas cho phép việc chỉnh sửa gene ở giai đoạn phôi trở nên dễ dàng hơn chỉ với 3 bước chính gồm (1) chuẩn bị hợp tử, (2) chuyển hỗn hợp gRNA và Cas9 mRNA vào trong hợp tử, và (3) chuyển phôi chứa hỗn hợp CRISPR/Cas9 vào con cái “mang thai hộ” để sản xuất thế hệ F0. Năm 2013, mô hình chuột KO (knockout) đầu tiên áp dụng kỹ thuật CRISPR/Cas9 được tạo ra từ phòng thí nghiệm Jaenisch. Theo nhóm nghiên cứu, việc kết hợp mRNA Cas9 và gRNA (Tet1, Tet2) đã tạo ra những con chuột mang 80% đột biến ở cả 2 gene này (Wang et al., 2103). Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng, việc sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 mang lại sự thuận tiện, hiệu quả và nhanh chóng trong việc tạo ra chuột knockout gene. Ngày nay, CRISPR/Cas9 đang được sử dụng mạnh mẽ để sản sinh ra các allele đột biến trên nhiều loài sinh vật khác như chuột cống (rat), heo, thỏ, chó, khỉ và cả tế bào gốc phôi người (Li-Fang & Jin[1]Song, 2016).

Leptin là một protein gồm 167 axit amin được tạo ra bởi gene leptin, một tín hiệu quan trọng trong việc điều chỉnh khối lượng mô mỡ và trọng lượng cơ thể, hoạt động bằng cách ức chế lượng thức ăn và kích thích tiêu hao năng lượng. Khiếm khuyết trong sản xuất leptin gây béo phì nghiêm trọng (Moon et al., 2013). Ở chuột, gene Lep chứa ba exon trong đó exon 2 và exon 3 mã hóa cho protein leptin (Lonnqvist et al., 1995). Vì vậy, các đột biến của gene Lep được nghiên cứu sâu để sản xuất các mô hình chuột béo phì và tiểu đường. Để loại bỏ chức năng của gene Lep, các gRNA thường được thiết kế nằm trong vùng exon 3, nhằm phá vỡ cấu trúc của protein leptin (Moon et al., 2013). Roh et al. (2018) đã tạo được các mô hình chuột béo phì và chuột tiểu đường thông qua công cụ CRISPR/Cas9.

Trong nghiên cứu này, gRNA được thiết kế hướng đến loại bỏ chức năng gene Lep, để tạo phôi chuột knockout, tạo chuột knockout làm tiền đề cho các nghiên cứu về tạo động vật biến đổi di truyền.

nqhuy