Phân lập, tuyển chọn dong vi khuẩn Lactic trong nem chua thịt có tiềm năng ứng dụng làm vi khuẩn giống trong sản xuất nem chua
Nem chua là một món ăn truyền thống nổi tiếng ở nhiều địa phương ở Việt Nam, thường xuất hiện trong những bữa ăn quan trọng như: Tết, Lễ, Kỷ niệm,… cho đến những bữa cơm hằng ngày.
Thành phần chính của nó bao gồm thịt nạc xay mịn (55–60%), da lợn luộc, thái mỏng (30–35%), và phối trộn với các thành phần khác như gạo rang xay, đường, muối, gia vị sau đó tạo thành hình khối vuông hoặc hình trụ nhỏ, lá vông hoặc lá chùm ruột thường được bao bên ngoài của các viên nem, sau đó viên nem được gói cẩn thận bằng lá chuối giúp tạo môi trường yếm khí cho quá trình lên men và ức chế sự xâm nhập của các vi sinh vật có khả năng gây bệnh. Quá trình lên men sẽ diễn ra trong 2 đến 4 ngày ở nhiệt độ môi trường (30-330C).
Bản chất quá trình lên men trong nem chua là nhờ vào hoạt động trao đổi chất của nhóm vi khuẩn Lactobacillus và coagulase-negative cocci (CNC). Dựa vào quá trình lên men axit lactic từ vi khuẩn có lợi với nhiều nguồn nguyên liệu, nem chua ngày càng được nhiều người ưa thích hơn bởi sự thơm ngon và vị chua đặc trưng của sản phẩm. Bên cạnh đó, thực phẩm lên men ngày càng được ưa chuộng vì cung cấp vi khuẩn lợi khuẩn sống cho hệ vi sinh đường ruột. Mặt khác, do không trải qua quá trình gia nhiệt nên phần lớn các chất dinh dưỡng trong thịt, đặc biệt là các vitamin, axit amin hoà tan không bị mất đi, đồng thời cũng hạn chế quá trình oxy hóa các axit béo tự do không bão hòa.
Tuy nhiên, do sử dụng hệ vi sinh vật từ nem cái (nem cái là nem thành phẩm có chất lượng tốt từ các mẻ sản xuất trước, được bảo quản để sử dụng như nguồn vi khuẩn giống cho các mẻ sản xuất sau) hoặc vi sinh vật tự nhiên từ lá vông hoặc lá chùm ruột nên chất lượng nem chua thường không ổn định, nhất là nem chua được sản xuất với quy mô công nghiệp. Vì vậy, nghiên cứu phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn lactic từ nem chua truyền thống làm nguồn vi khuẩn giống thay thế hệ vi khuẩn trong nem cái giúp cải thiện và ổn định chất lượng của nem chua thành phẩm, đồng thời hạn chế vi khuẩn tạp nhiễm đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho nem chua.
1. Vật liệu nghiên cứu
Nguồn vi sinh vật: Từ nhiều loại nem thành phẩm khác nhau nổi tiếng trên thị trường được mua tại siêu thị Coopmart Cần Thơ (số 01 Hoà Bình, Phường Tân An, Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ) bao gồm (1) nem chua sản xuất theo qui mô truyền thống, (2) nem chua sản xuất theo qui mô công nghiệp và nem chua thành phẩm của cơ sở sản xuất nem tại tỉnh Vĩnh Long.
Paste thịt có gia vị đã bổ sung “nem cái” nhưng chưa lên men và paste thịt chưa bổ sung “nem cái” được một cơ sở sản xuất nem ở tỉnh Vĩnh Long cung cấp và vận chuyển đến Vườn ươm Công nghệ Công nghiệp Việt Nam - Hàn Quốc ở nhiệt độ (2-40C) trong khoảng 2 giờ.
Môi trường sử dụng: Plate Count Agar (PCA; Ấn Độ), de Man, Rogosa and Sharpe Agar (MRS Agar; Ấn Độ và Merck – Đức), de Man, Rogosa and Sharpe Broth (MRS Broth; Ấn Độ và Merck – Đức), Sabouraud có bổ sung 0,05(g/L) Chloramphenicol, LB (Luria - Bertani, Ấn Độ) Sodium chloride (NaCl, Trung Quốc), Sodium hydroxide (NaOH, Trung Quốc), Phenolphtalein (C20H14O11, Trung Quốc).
2. Phương pháp nghiên cứu
Quy trình phân lập vi khuẩn lactic: Cân 10 g nem cho vào túi dập mẫu vô trùng có chứa 90 ml nước muối sinh lý 0,85%. Mẫu được đồng nhất khoảng 10 phút. Sau đó, 1 ml dung dịch được hút sau khi đồng nhất, tiến hành pha loãng ở nồng độ thích hợp. Tiếp theo, 0,1 ml dung dịch pha loãng được cho vào đĩa petri có chứa môi trường MRS agar + CaCO3 (0,5%), dùng que cấy trang trang đều lên mặt môi trường và để khô tự nhiên. Các đĩa đã khô được đem vào tủ ủ và lật ngược đĩa lại ủ ở 37ºC trong 48 giờ. Các khuẩn lạc mọc riêng lẻ được chọn, có khả năng phân giải CaCO3 và có hình dạng màu sắc khác nhau đem tăng sinh trong môi trường MRS broth (ủ 370C, 24-48 giờ). Ria được cấy trên môi trường MRS agar + CaCO3 (0,5%) theo đường zic zac để chọn các khuẩn lạc rời rạc. Những dòng vi khuẩn được chấp nhận có hình dạng trắng ngà hay trắng trong, bờ láng, lồi, bìa nguyên hoặc chia thùy.
Phương pháp chuẩn độ Therner: Khả năng sinh axit lactic mạnh hay yếu của các dòng vi khuẩn lactic được xác định bằng phương pháp chuẩn độ Therner; lấy 10 ml dịch nuôi lắc trong 1 giờ cho vào bình tam giác, bổ sung 20 ml nước cất và 1-2 giọt Phenolphtalein 1%. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại. Ghi lại thể tích NaOH đã dùng để chuẩn độ.
Phương pháp tuyển chọn: Xác định hình thái của dòng đã phân lập (dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm hình thái tế bào, nhuộm Gram) và kiểm tra đặc tính sinh hóa (thử catalase, khả năng sinh axit, nhuộm bào tử và khả năng di động). Từ đó, các dòng vi khuẩn lactic đã phân lập được xác định, tuyển chọn.
Phương pháp xác định kiểu lên men: Phương pháp xác định kiểu lên men lactic đồng hình và dị hình vào khả năng sinh khí CO2 trong quá trình lên men glucose của vi khuẩn lactic. Cho chuông Durham vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường MRS, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút; cấy dòng vi khuẩn lactic cần thử vào ống nghiệm, nuôi ở 370C trong 48 giờ. Nếu trong chuông Durham có bọt khí thì chứng tỏ dòng vi khuẩn sinh khí CO2 (lên men lactic dị hình); nếu trong chuông Durham không xuất hiện bọt khí thì chứng tỏ vi khuẩn không sinh khí CO2 (lên men lactic đồng hình).
Phương pháp đo mật độ quang: Tiến hành tăng sinh các dòng vi khuẩn lactic trong các bình tam giác có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp ở điều kiện nuôi cấy tĩnh và nuôi ở nhiệt độ 370C để vi khuẩn lactic sinh trưởng và phát triển trong môi trường dinh dưỡng. Các giống được nuôi tăng sinh trong môi trường MRS broth, tiến hành ly tâm lạnh thu sinh khối, sau đó tiến hành pha loãng phần sinh khối thu được bằng 2 mL nước muối 0,85% đã tiệt trùng; hút 1 ml tiến hành đo OD ở bước sóng 600 nm, để đạt được giá trị OD từ 0,5 đến 0,6. Để khảo sát khả năng sinh trưởng và phát triển của 19 dòng vi khuẩn lactic, trong quá trình nuôi cấy trong môi trường MRS broth sau mỗi 4 giờ, ta tiến hành lấy mẫu đo mật độ quang (OD) một lần ở bước sóng 600 nm trên máy UV– Vis.
Phương pháp nhận diện vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử: Chọn dòng LAB có hoạt tính tối ưu để định danh bằng phương pháp sinh học phân tử giải trình gen bằng 16S rRNA. DNA được tách chiết và thực hiện PCR với mồi đặc hiệu vùng 16s rRNA. Sau đó, trình tự được giải trực tiếp và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI, từ đó xác định được chính xác loại vi khuẩn dựa trên tỉ lệ tương đồng của nó với ngân hàng dữ liệu NCBI. Quy trình được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Cần Thơ.
3. Kết luận
Nghiên cứu đã phân lập, tuyển chọn và xác định dòng loại vi khuẩn axit lactic (LAB) từ nem chua của Việt Nam, loại vi khuẩn có các đặc tính phù hợp để sử dụng làm nguồn vi khuẩn giống. Mười chín dòng vi khuẩn lactic đã được phân lập trên môi trường MRS agar. Đa số khuẩn lạc có hình tròn, màu trắng đục, trắng ngà, nhô cao hoặc phẳng, mép phân thùy hoặc nguyên vẹn. Trong 19 dòng vi khuẩn phân lập từ nem chua, có 36,8% dòng lên men đồng hình, 63,2% dòng lên men dị hình. Thử nghiệm khả năng sinh axit lactic và làm giảm pH cho thấy NTL2, NTV2 có khả năng làm giảm pH nhanh hơn các dòng còn lại (lần lượt là 3,65 và 3,7), đồng thời cũng tạo ra lượng axit lactic cao nhất là 19,13 mg/ml và 18,23 mg/ml. Dựa vào các tính chất điển hình của vi khuẩn lactic, 12 dòng được chọn để định danh bằng phân tích trình tự 16s rDNA. kết quả cho thấy 6 dòng được xác định là dòng Lacticaseibacillus rhamnosus, 2 dòng là dòng Lactobacillus casei, 2 dòng là dòng Lactiplantibacillus pentosus, 1 dòng tương đồng với dòng Lactiplantibacillus argentoratensis và 1 dòng được xác định là dòng Lactobacillus saniviri.