Hiện nay, ngành công nghiệp dược vẫn còn phụ thuộc nhiều vào nguồn nguyên liệu allopurinol được nhập khẩu từ các công ty nước ngoài. Do đó, việc kiểm tra chất lượng tạp trong nguyên liệu cũng như thành phẩm trước và trong quá trình lưu hành là một yêu cầu bắt buộc được quy định trong DĐVN V; BP 2021; USP 44. Trong đó tạp chất A, B, C, D, E được chứng minh tác dụng lên gen HLA-B*5801 gây hội chứng steven Jonhson[8], tạp Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethyl)amino pyrazol-4-carboxylat (tạp F theo USP standard 2022) thuộc nhóm 3 cấu trúc có khả năng gây ung thư, đột biến gen[9]. Tạp A và B là tạp phân hủy của allopurinol cần được kiểm cả trong nguyên liệu và thành phẩm. Trong khi đó các quy trình Dược Điển trên chỉ định lượng từng tạp hoặc một nhóm các tạp, hệ số phân giải giữa các tạp thấp, đặc biệt tạp B và C nhỏ hơn 1,5. Chưa có quy trình tối ưu để định lượng đồng thời 6 tạp trên trong thành phẩm. Từ những lí do trên, nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A,B,C,D,E,F của allopurinol bằng phương pháp LC-MS/MS” với mục tiêu: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A,B,C,D,E,F của allopurinol bằng phương pháp LC[1]MS/MS theo hướng dẫn của ICH.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tạp chất liên quan A, B, C, D, E, F của allopuirnol, xây dựng quy trình định lượng đồng thời bằng hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS theo hướng dẫn thẩm định quy trình của ICH Q2(R2) và EC-657/2002.

Kết quả nghiên cứu Các ion phân tử ban đầu và ion phân mảnh định lượng đặc trưng của tạp A tạp A (126,9→109,9); tạp B (155,1→138); tạp C (178,8→78,9); tạp D (155,86→127,9); tạp E (183,87→109,9); tạp F (279,1→187) và allopuirnol (136,9→109,9). Điều kiện khối phổ tối ưu là: Nhiệt độ khí hoá hơi (oC): 400oC, tốc độ dòng khí hoá hơi (l/h):900 l/h, thế Cone (V): 15-26V, thế mao quản (kV):4kV, năng lượng buồng khí va chạm (V): 12-25V. Điều kiện sắc ký: pha tĩnh cột sắc kí pha đảo Gemini – NX C18 (15cm; 4,6mm; 5𝜇m ;Phenomenex), pha động acetonitril - nước acid formic 0,05% theo chương trình gradient, nhiệt độ cột 25˚C, thể tích tiêm mẫu 10 µL, tốc độ dòng 0,8 mL/phút. Thẩm định quy trình theo hướng dẫn ICH: quy trình đạt độ đặc hiệu – chọn lọc; độ tuyến tính có hệ số tương quan từ 0,995 – 0,999; giới hạn phát hiện từ 3-10ppb; giới hạn định lượng 10ppb; độ đúng độ chính xác đạt yêu cầu RSD ≤ 2%.

Điều kiện khối phổ và sắc ký thích hợp Cấu trúc đặc trưng của các chất phân tích phù hợp với kiểu ion hóa dương (ES+). Các thông số khối phổ được tối ưu hóa để tín hiệu các mảnh ghi nhận được cao nhất. Tín hiệu các chất tăng theo nhiệt độ dòng khí bay hơi và tốc độ dòng khí bay hơi, tối ưu ở giá trị 400oC và 900 L/giờ. Do cấu trúc tương tự nhau, nên thế cone phù hợp để bắt các ion nằm ở khoảng 15V đến 26V. Hệ pha động trong rửa giải sắc ký cũng được khảo sát. Kết quả cho thấy rằng khi sử dụng chất điều chỉnh pH là acid formic < 0,1% cho tín hiệu tốt hơn, các pic cân đối và gọn hơn so với hệ pha động chỉ sử dụng dung môi hữu cơ và nước. Khi sử dụng acid formic 0,05%/H2O cả 7 peak thu được đều gọn, không bị chẻ và hình dạng đối xứng. Chính vì vậy pha động là ACN - Acid fomic 0,05% trong nước được lựa chọn. Tốc độ dòng được lựa chọn phân tích là 0,8 mL/phút để rút ngắn thời gian chạy mẫu, đồng thời làm peak xuất hiện gọn đẹp.