Từ lâu, các nhà khoa học trên thế giới đã có những nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của loài Chùm ruột. Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu tại Việt Nam về các thành phần hóa học dễ bay hơi của dược liệu này. Bên cạnh đó, các tài liệu cũng cho biết rằng, alkaloid là nhóm hợp chất tự nhiên chứa nitơ quan trọng từ thực vật, được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y dược học, vì rất nhiều hoạt chất thuộc nhóm này có khả năng chữa bệnh cao và độc đáo.

Trong khi đó, proanthocyanidin là các fl avonoid oligomeric, một nhóm các polyphenol được tìm thấy trong nhiều loại thực vật với những hoạt tính sinh học quan trọng như chống oxy hóa, bảo vệ gan... Trên những cơ sở đó, bài báo tập trung khảo sát các thành phần bay hơi, cũng như xác định hàm lượng alkaloid và proanthocyanidin toàn phần từ lá cây Chùm ruột (Phyllanthus acidus L.).

Lá cây Chùm ruột được thu hái. Sau đó, mẫu được phơi khô, xay thành bột mịn để dùng cho quá trình nghiên cứu.

Hóa chất: Caffein chuẩn (Sigma Chemical, Bangalore), vanillin, bromocresol xanh, methanol, chloroform, ethanol và các hóa chất thường quy khác.

Thiết bị: Máy đo quang phổ UV-Vis và các thiết bị thường quy khác.

1. Khảo sát các thành phần bay hơi trong lá Chùm ruột

Cao chiết ethanol của lá Chùm ruột được gửi đến Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Cần Thơ, phân tích thành phần bay hơi bằng phương pháp GC-MS có tham khảo tài liệu [7], với các thông số như sau: Cột DB-5 ms (30 m x 0,25 𝜇𝑚 x 0,25 𝜇𝑚). Khí mang helium (99,999%) với tốc độ dòng không đổi là 1 mL/phút, thể tích tiêm mẫu là 2 μL. Nhiệt độ buồng tiêm mẫu là 250⁰C, nhiệt độ nguồn ion là 250⁰C. Nhiệt độ lò được lập trình từ 50⁰C (giữ đẳng nhiệt trong 2 phút), tăng 5⁰C/phút đến 100⁰C, sau đó tăng 10oC/phút đến 150oC, tiếp tục tăng 25⁰C/phút đến nhiệt độ 250⁰C. Tổng thời gian chạy sắc ký là 22 phút. Tỷ lệ phần trăm tương đối của mỗi thành phần được tính bằng cách so sánh diện tích đỉnh trung bình của nó với tổng diện tích. Phổ khối của các thành phần chưa biết được so sánh với phổ của các thành phần đã biết được lưu trữ trong thư viện NIST.

2. Định lượng alkaloid toàn phần

Nguyên tắc: Các alkaloid sẽ phản ứng với bromocresol xanh tạo thành phức có màu vàng. Đo độ hấp thu của phức này ở bước sóng 470 nm và dựa vào đường chuẩn caffein tính ra hàm lượng alkaloid toàn phần có trong mẫu phân tích.

Cách tiến hành: Dựa theo phương pháp của Biju J. và cộng sự. Chất đối chứng được sử dụng là caffein.

Chuẩn bị các dung dịch thuốc thử

Dung dịch bromocresol xanh (BCG) được điều chế bằng cách đun nóng 69,8 mg bromocresol xanh với 3 mL NaOH 2 N và 5 mL nước cất cho đến khi tan hoàn toàn và dung dịch được pha loãng đến 1 L bằng nước cất.

Dung dịch đệm phosphate (pH 4,7) được điều chế bằng cách điều chỉnh pH của sodium phosphate 0,2 M (71,6 g Na2HPO4 trong 1 L nước cất) đến 4,7 với 0,2 M acid citric (42,02 g acid citric trong 1 L nước cất).

Xây dựng đường chuẩn caffeine

Dung dịch chuẩn caffein 0,1 mg/mL: Hòa tan 1 mg caffein chuẩn trong 10 mL nước cất. Quy trình thực hiện: Hút lượng dung dịch chứa caffein một cách chính xác (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5 mL) vào từng phễu chiết khác nhau. Sau đó, thêm 5 mL dung dịch đệm phosphate pH 4,7 và 5 mL dung dịch bromocresol xanh vào từng phễu, lắc mỗi hỗn hợp lần lượt với 1, 2, 3 và 4 mL chloroform. Các chiết xuất chloroform được thu thập trong bình định mức 10 mL và sau đó pha loãng đến vạch với chloroform. Độ hấp thụ của phức hợp trong chloroform được đo ở 470 nm đối với mẫu trắng được chuẩn bị như trên nhưng không có caffein.

Xác định hàm lượng alkaloid toàn phần từ lá Chùm ruột

Bột lá Chùm ruột (100 g) được chiết ngâm dầm bằng methanol trong 24 giờ. Dịch chiết được lọc và cô quay cho bay hơi hết methanol ở 45oC. Cao chiết được hòa tan trong HCl 2 N và sau đó được lọc. Một (01) mL dung dịch này được chuyển sang một phễu tách và rửa sạch bằng 10 mL chloroform (3 lần). Độ pH của dung dịch này được điều chỉnh tới trung tính với 0,1 N NaOH. Sau đó, thêm 5 mL dung dịch BCG và 5 mL dung dịch đệm phosphate vào dung dịch này. Hỗn hợp được lắc và chiết lần lượt với 1, 2, 3 và 4 mL chloroform bằng cách lắc mạnh. Các dịch chiết được cho vào bình định mức 10 mL và bổ sung đến vạch với chloroform. Sau đó, đo độ hấp thu ở bước sóng 470 nm. Mẫu trắng như trên nhưng không có cao chiết.

3. Định lượng proanthocyanidin toàn phần

Nguyên tắc: Các proanthocyanidin sẽ phản ứng với vanillin-methanol trong dung dịch acid chlohydric tạo sản phẩm có màu. Đo độ hấp thu của phức này ở bước sóng 500 nm và dựa vào đường chuẩn catechin tính ra hàm lượng proanthocyanidin toàn phần có trong mẫu phân tích.

Cách tiến hành: Dựa trên phương pháp của Osamuyimen O.I. và cộng sự. Chất đối chứng là catechin. Đường chuẩn catechin Đường chuẩn catechin được dùng theo tài liệu tham khảo của Osamuyimen O.I. và cộng sự y = 0,5825x, R2 = 0,9277. Trong đó, x là độ hấp thu và y là lượng catechin tương đương.

Xác định hàm lượng proanthocyanidin toàn phần từ lá Chùm ruột

Lá Chùm ruột (100 g) được chiết ngâm dầm bằng methanol trong 24 giờ. Dịch chiết được lọc và cô quay cho bay hơi hết methanol ở 45⁰C, thu được cao methanol. Cân 1 mg cao hòa tan trong 10 mL methanol, lọc, thu được dung dịch cao chiết có nồng độ 0,1 mg/mL. Hút 0,5 mL dung dịch chiết xuất 0,1 mg/mL được trộn với 3 mL dung dịch vanillin trong methanol 4% và 1,5 mL dung dịch HCl 2 N. Hỗn hợp được để yên ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 500 nm.

4. Kết luận

Lá cây Chùm ruột có chứa các hợp chất như alkaloid, fl avonoid, tannin, triterpen, steroid, đường khử và saponin. Từ cao ethanol lá Chùm ruột phát hiện được 16 cấu tử bay hơi, trong đó các chất 3-hexen-2-one; 4-butoxy-2-butanone; 3,3-dimethyl-2-hexanone chiếm tỉ lệ nhiều nhất. Bên cạnh đó, xác định trong lá Chùm ruột có hàm lượng alkaloid là 1,64 mg tương đương caffein/g bột dược liệu và hàm lượng proanthocyanidin là 46,88 mg tương đương catechin/g bột dược liệu.