Năng lượng sinh học bao gồm các nguồn năng lượng được sản xuất từ phụ phẩm nông nghiệp, nước thải, bã phế thải hữu cơ công nghiệp, rác thải.

Ethanol được xem là nguồn năng lượng sinh học an toàn và được tạo ra bởi quá trình lên men. Ethanol khi cháy không gây độc hại, giảm lượng CO2 và giảm lượng khí gây hiệu ứng nhà kính khác.

Vi sinh vật chịu điều kiện khắc nghiệt đóng vai trò quan trọng trong công nghệ sinh học và kiểm soát sự ô nhiễm môi trường, đáng chú ý là các vi sinh vật chịu nhiệt có thể biến dưỡng ở nhiệt độ từ 37 đến 50°C. Vi khuẩn chịu nhiệt có tiềm năng ứng dụng trong nhiều qui trình công nghiệp bao gồm việc sản xuất ethanol vì chúng có khả năng lên men ở nhiệt độ cao. Chúng còn được ứng dụng để sản xuất enzyme như cellulase từ phụ phẩm nông nghiệp với chi phí thấp. Mặt khác, lên men ở nhiệt độ cao chuyển hóa hoàn toàn cơ chất thành sản phẩm cuối cùng. Nhiều vi khuẩn chịu nhiệt đã được phân lập và nghiên cứu với khả năng lên men ethanol. Lên men ở nhiệt độ cao giúp gia tăng tốc độ phản ứng, giảm sự tiêu thụ năng lượng bởi giảm quá trình làm mát thùng lên men và giúp giảm thiểu hàm lượng khí oxy trong thùng này tạo môi trường yếm khí hơn nên quá trình lên men được hiệu quả. Do đó, những vi sinh vật này có ý nghĩa rất quan trọng đối với các nước nhiệt đới nơi mà phải tốn nhiều chi phí cho hệ thống làm mát. Mục tiêu nghiên cứu là phân lập, tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng lên men ethanol tốt và chịu được nhiệt độ cao.

1. Vật liệu nghiên cứu: Thu thập mẫu trái cây chín (chuối, táo, nho, xoài), mùn cưa, bã mía, rỉ đường, hoa cây ăn quả (xoài, mận, táo, nhãn) và mật ong. Các mẫu được bảo quản trong túi thanh trùng và chuyển về phòng thí nghiệm.

2. Phương pháp nghiên cứu:

Phân lập vi khuẩn: Cho 2 g mẫu vào ống nghiệm chứa 20 ml môi trường Malt Yeast Peptone Glucose (MYPG). Môi trường MYPG gồm yeast extract 0,3%, peptone 0,5%, malt extract 0,3% và glucose 2%, khử trùng ở 121oC trong 15 phút, bổ sung ethanol 3% (v/v) và sporal 0,02%. Ủ 24 giờ ở 30^oC. Dùng micropipette chuyển 1ml vào dĩa petri có chứa môi trường MYPG agar (yeast extract 0,3%, peptone 0,5%, malt extract 0,3%, glucose 2% và agar 2%) đã khử trùng ở 121^oC trong 15 phút. Cấy trải mẫu, ủ 48 giờ ở 30^oC. Tiếp tục cấy chuyền trên môi trường MYPG agar. Quan sát dưới kính hiển vi (X100) để xác định độ đồng nhất của tế bào, chụp hình lưu trữ. Trữ mẫu ở 4^oC trong ống thạch nghiêng với môi trường MYPG agar.

Khảo sát khả năng lên men đường glucose: Nuôi sinh khối các dòng đã phân lập từ thí nghiệm 1 trong môi trường MYPG đã khử trùng ở 121^oC trong 15 phút, ủ 24 giờ ở 30oC. Lấy 1ml dung dịch mẫu cho vào chai Durham có chứa 9ml dung dịch môi trường YPG (yeast extract 0,3%, peptone 0,5% và glucose 20%) đã khử trùng ở 115^oC trong 10 phút. Lắc thật đều để dung dịch đường tràn đầy vào ống thủy tinh úp ngược nằm bên trong chai Durham, ủ ở 30^oC. Đo chiều cao cột khí CO₂ sinh ra trong ống thủy tinh úp ngược tại các thời điểm 24, 48, 72, 96, 120 giờ.

Khảo sát khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn được tuyển chọn: Cấy zigzag các dòng vi khuẩn đã sơ tuyển trên các dĩa petri chứa môi trường MYPG. Ủ các dĩa petri ở các mức nhiệt độ khác nhau 30, 35, 40, 45 và 50^oC. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn sau 24, 48 và 72 giờ trên bề mặt môi trường.

Đánh giá khả năng lên men các loại đường: Nuôi sinh khối các dòng vi khuẩn có khả năng lên men mạnh và phát triển ở nhiệt độ cao trong môi trường MYPG. Thực hiện phương pháp lên men trong chai Durham với 6 loại đường glucose, sucrose, lactose, galactose, arabinose và xylose. Xác định chiều cao cột khí CO₂ sinh ra trong ống thủy tinh úp ngược sau 120 giờ.

Khảo sát đặc tính sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng lên men ethanol: Thực hiện một số phản ứng để xác định đặc tính sinh hóa dòng vi khuẩn như nhuộm Gram, catalase, oxidase, thủy phân gelatine, thủy phân tinh bột, urease.

Định danh dòng vi khuẩn được tuyển chọn: Ly trích DNA vi khuẩn. Khuếch đại trình tự gene 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt. Sử dụng BLAST để so sánh trình tự đã giải với dữ liệu trên ngân hàng gene ở trang web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

Phương pháp xử lý số liệu: Tất cả số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình STATGRAPHICS Plus 5.1.

3. Kết luận

Phân lập được 27 dòng vi khuẩn từ 12 nguồn nguyên liệu như trái cây chín, mùn cưa, bã mía, rỉ đường, hoa cây ăn quả và mật ong.

Trong 11 dòng vi khuẩn được sơ tuyển có biểu hiện khả năng lên men mạnh, trong đó có 7 dòng MC3, BM2, BM3, RD, HM1, HM2 và MO có thể phát triển ở nhiệt độ cao đến 50^oC. Các dòng vi khuẩn MC3, BM2, HM1, HM2 và MO sử dụng được 6 loại đường (glucose, sucrose, lactose, galactose, arabinose và xylose), trong khi 2 dòng vi khuẩn BM3 và RD lên men được 5 loại đường (glucose, sucrose, lactose, galactose và xylose). Dòng MO được xác định là Bacillus subtilis.