Các nghiên cứu gần đây cho thấy microRNA có vai trò chính trong việc điều hòa hệ thống miễn dịch ở cây lúa. Cho đến nay, có hơn 60 miRNAs đáp ứng khác biệt về mặt biểu hiện với sự xâm nhiễm của M. oryzae trên các giống lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn đã được xác định dựa trên kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới. Một số miRNA như osa-miR162a được mô tả là điều hòa tăng đối với tính kháng nấm M. oryzae của lúa. Trên lúa, osa-miR162 là một họ microRNA với 2 thành viên bao gồm osa-miR162a và osa-miR162b, có gen đích là OsDCL1. Do vậy, osa-miR162 còn đóng vai trò điều hòa ngược quá trình tạo ra các miRNA khác.

Các nghiên cứu gần đây cho thấy, biểu hiện tăng osa-miR162 làm tăng khả năng kháng nấm M. oryzae thông qua sự ức chế gen đích OsDCL1, đồng thời osa-miR162 làm tăng mức độ biểu hiện của các gen kháng và tăng nồng độ H₂O₂ giúp cây lúa chống lại nấm M. oryzae tại vị trí xâm nhiễm. Tuy nhiên, khi biểu hiện tăng Osa-miR162a lại làm giảm sản lượng lúa. Do đó, có thể nhận định osa-miR162a có vai trò cân bằng khả năng kháng nấm M. oryzae và sản lượng lúa. Hầu hết các nghiên cứu trước đây về mức độ biểu hiện của osa-miR162a đều tiến hành so sánh giữa 01 giống lúa kháng và 01 giống lúa mẫn cảm, mà chưa đánh giá trên nhiều giống lúa khác, cũng như các giống lúa trồng tại Việt Nam.

Trong nghiên cứu này, mức độ biểu hiện của osa-miR162a được đánh giá trên 10 giống lúa thuộc hai nhóm mẫn cảm và chống chịu với M. oryzae ở các thời gian sau lây nhiễm (hours post infection, hpi) bằng phương pháp real-time qRT-PCR. Phân tích thống kê cho thấy mức độ biểu hiện tăng của osa-miR162a được quan sát ở giai đoạn 48 hpi và 72 hpi trên các giống lúa thuộc nhóm chống chịu M. oryzae so với các giống lúa thuộc nhóm mẫn cảm với M. oryzae..

1. Các giống lúa, mẫu nấm gây bệnh đạo ôn và môi trường nuôi cấy

Nghiên cứu sử dụng 10 giống lúa bao gồm năm giống lúa cho mỗi nhóm chống chịu và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn M. oryzae. Nguồn mẫu nấm gây bệnh đạo ôn M. oryzae LBT2 được lấy từ bộ sưu tập mẫu nấm gây bệnh đạo ôn M. oryzae tự phân lập, được thu thập ở các vùng trồng lúa thuộc các tỉnh thành miền Bắc, miền Trung và miền Nam Việt Nam. Thí nghiệm chủng bệnh trên các giống lúa được thực hiện bằng mẫu nấm phân lập M. oryzae LBT2 theo quy trình như sau: Các giống lúa được trồng thành cây con 14 ngày tuổi, mẫu nấm M. oryzae LBT2 được nuôi cấy trên môi trường oatmeal agar và kích thích bào tử nảy mầm dưới đèn Blacklight tạo UV trong thời gian 2-3 ngày ở 25⁰C. Tiếp theo, bào tử nấm M. oryzae LBT2 được pha loãng ở mật số 1×105 - 5×105 bào tử/mL và trộn với dung dịch Tween20 0,1%, sau đó phun sương huyền phù bào tử này lên lá lúa 14 ngày tuổi. Các bào tử của chủng nấm LBT2 này có tỉ lệ nảy mầm và hình thành giác bám xâm nhiễm đạt hiệu quả sau 8 giờ trên bề mặt nhân tạo và lá lúa, chủng này có khả năng phá vỡ tính kháng của các giống lúa có khả năng kháng như IR50404. Do đó, việc xác định sự thay đổi tích lũy biểu hiện của osa-miR162a trong nghiên cứu được đánh giá ở các thời điểm 24, 48 và 72 giờ sau lây nhiễm.

Việc đánh giá nhóm chống chịu và mẫn cảm M. oryzae của các giống lúa sử dụng trong thí nghiệm này đã được chọn dựa trên kết quả của nghiên cứu trước đây dựa trên kết quả đánh giá mức độ nhiễm bằng phần mềm Access 2.0.

2. Phương pháp nghiên cứu

2.1. Chiết xuất RNA

RNA tổng số (bao gồm miRNA) của mẫu lá nhiễm bệnh ở các thời điểm sau lây nhiễm khác nhau (24, 48 và 72 hpi) được chiết xuất bằng Trizol theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Thermo Fisher Scientific, USA). Nồng độ RNA tổng số sau khi chiết xuất sẽ được đo bằng thiết bị NanoDrop™ 1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., USA). Tất cả các mẫu RNA được xử lý với Dnase I, Amplification Grade (Invitrogen, USA) để phân hủy các DNA dư. Cuối cùng, 1 μg RNA tổng được hòa tan với buffer DNase I 1X để cho ra dung tích là 50 μL, tiếp đó thêm DNase (200 U/ml) và ủ ở 37⁰C trong 10 phút. Để bất hoạt phản ứng, EDTA 0,5M được thêm vào và ủ ở 75⁰C trong 10 phút.

2.2. Phân tích mức độ biểu hiện tương đối của osa-miR162a bằng phương pháp qRT-PCR

Mức độ biểu hiện tương đối của osa-miR162a được thực hiện bằng phương pháp qRT-PCR với kít SensiFAST SYBR No-ROX (Bioline, UK) và các mồi chuyên biệt cho osa-miR162a với trình tự (F: 5’GCGAATTTCTTTGAGAGGGTG3’, R: 5’ACTGGATGCAGAGGTTTATCG3’) như trong mô tả của các nghiên cứu trước đây. Phản ứng real-time PCR được thực hiện bằng thiết bị Mygo Pro (IT-IS Life Science Ltd, UK) ở chu trình như sau: biến tính ban đầu 95⁰C trong 2 phút, 40 chu kỳ bao gồm (biến tính 95⁰C trong 10 giây, bắt cặp ở 65⁰C trong 10 giây, kéo dài ở 72⁰C trong 20 giây) và bảo quản sản phẩm lạnh ở nhiệt độ 10⁰C. Gen OsUbi1 được sử dụng làm đối chứng vì sự biểu hiện ổn định ở mọi tác động. So sánh tương đối mức độ biểu hiện của osa-miR162a được ước lượng dựa trên giá trị 2-ΔCt. Giá trị chu kỳ ngưỡng (threshold cycle – Ct) là con số chu kỳ mà ở đó giá trị Ct tương quan ngược với nồng độ mẫu ban đầu. Điều đó có nghĩa là nếu mẫu có nồng độ DNA ban đầu thấp thì nó sẽ có Ct cao. Tương tự, mẫu với nồng độ ban đầu cao thì Ct thấp. Mức độ biểu hiện được đánh giá bằng phương pháp 2-ΔCt với ΔCt = Ct của mẫu osa-miR162a – Ct của OsUbi1.

2.3. Phân tích thống kê

Các dữ liệu được thể hiện ở dạng trung bình (mean) ± độ lệch chuẩn (standard deviation). Phân tích biểu đồ hộp (Box plot) được thực hiện dựa trên phương pháp so sánh T-test. Các phân tích thống kê được thực hiện bằng phép thử T-test và ý nghĩa thống kê được xác định ở P < 0,05. Các thí nghiệm đã được thực hiện với 3 lần lặp lại.

3. Kết luận

Nghiên cứu đánh giá được mức độ biểu hiện của osa-miR162a trên 10 giống lúa thuộc 2 nhóm lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm M. oryzae ở các thời điểm 24, 48 và 72 hpi. Ở thời điểm 0 hpi và 24 hpi, mức độ biểu hiện của osa-miR162a khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa nhóm lúa chống chịu và mẫn cảm với M. oryzae. Ở thời điểm 48 hpi và 72 hpi, mức độ biểu hiện của osa-miR162a của nhóm lúa chống chịu cao hơn 4,4 lần so với nhóm lúa mẫn cảm với nấm M. oryzae. Kết quả đạt được trong nghiên cứu này cho thấy osa-miR162a có thể được sử dụng như một chỉ thị liên quan đến khả năng chống chịu và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, hứa hẹn là một công cụ hữu ích cho các công tác đánh giá và lai tạo lúa ở nước ta hiện nay.