Nấm Mucor lusitanicus CBS277.49 (tên cũ là Mucor circinelloides f. lusitanicus CBS277.49) là một trong các loài nấm mô hình dùng cho nhiều nghiên cứu khác nhau như cơ chế phân tử của RNAi, sinh tổng hợp carotene, lipid và bệnh mucormycosis. Loài nấm này cũng là một trong số các tác nhân gây bệnh mucormycosis.

Với nhiều đặc điểm ưu việt, Galleria mellonella trong những năm trở lại đây đã và đang trở thành. một trong những sinh vật mô hình không xương sống được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu về các bệnh nhiễm trùng và nhiễm nấm. Trong tự nhiên, ấu trùng của loài bướm này thường xuyên tiếp xúc với rất nhiều tác nhân gây bệnh, do đó ở chúng có sự hình thành và phát triển hệ miễn dịch bảo vệ cơ thể với nhiều điểm tương tự về cấu trúc và chức năng với hệ thống miễn dịch bẩm sinh của động vật có xương sống. Nhờ đó, ấu trùng G. mellonella có thể được sử dụng cho nghiên cứu khoa học, cung cấp nhiều thông tin hữu ích về cơ chế gây bệnh, khả năng gây bệnh, sự tương tác giữa tác nhân gây bệnh với vật chủ cũng như hiệu quả của các chất kháng sinh. So với các động vật mô hình không xương sống khác, giới hạn nhiệt rộng (18-37⁰C) của ấu trùng G. mellonella tạo điều kiện thuận lợi để mô phỏng các trạng thái sinh lý của động vật có vú nói chung và con người nói riêng. Thêm vào đó, loài côn trùng này còn đáp ứng được các yêu cầu cần có đối với một sinh vật mô hình điển hình như có tốc độ sinh trưởng và sinh sản nhanh, dễ thao tác, chi phí nhân nuôi thấp, dễ duy trì trong điều kiện phòng thí nghiệm mà không cần tới các thiết bị đắt tiền. Hệ gen của loài này đã được giải mã hoàn chỉnh gần đây cho phép các nhà khoa học mở rộng phạm vi tiếp cận và áp dụng các công cụ tin sinh học và sinh học phân tử trong các nghiên cứu sử dụng G. mellonella làm động vật mô hình.

So với các động vật mô hình có xương sống, các động vật mô hình không xương sống đã và đang được sử dụng ngày càng rộng rãi hơn trong các nghiên cứu về bệnh nấm mucormycosis; và trong số đó G. mellonella với nhiều ưu điểm đã trở thành động vật mô hình không xương sống được lựa chọn nhiều nhất trong những năm gần đây. Nhiều đánh giá in vivo về khả năng gây bệnh của các chủng khác nhau của nhiều loài nấm thuộc bộ Mucorales, trong đó có Mucor lusitanicus đã được nghiên cứu tiến hành trên đối tượng ấu trùng G. mellonella. Tuy nhiên, các báo cáo khác nhau sử dụng liều lượng khác nhau của bào tử nấm gây bệnh và điều kiện nuôi khác nhau dẫn đến những khó khăn trong việc tái lập kết quả nghiên cứu. Báo cáo này tiến hành xác định điều kiện thí nghiệm thích hợp sử dụng ấu trùng này và thử nghiệm trên một số dòng nấm M. lusitanicus đột biến.

1. Phương pháp nghiên cứu

1.1. Vật liệu

Dòng nấm M. lusitanicus R7B (leuA^- pyrG⁺) được dùng làm chủng kiểu dại, được cung cấp bởi Bộ môn Di truyền học và Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Đại học Murcia, Tây Ban Nha.

Ấu trùng G. mellonella tuổi 5-6 được cung cấp bởi Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện hàn lâm khoa học Việt Nam.

1.2. Điều kiện nuôi cấy và sinh trưởng của vi sinh vật

Nấm Mucor lusitanicus được nuôi cấy ở 26⁰C trong điều kiện chiếu sáng liên tục. Các chủng nấm được nuôi trên môi trường MMC (casamino acids 10 g/L, yeast nitrogen base w/o amino acids 0,5 g/L, glucose 20 g/L), YPG (cao nấm men 10 g/L, glucose 20 g/L, peptone 20 g/L). Môi trường có thể được bổ sung uridine (200 μg/mL) hoặc leucine (20 μg/mL) tùy theo mục đích thí nghiệm.

1.3. Đánh giá in vivo khả năng gây bệnh của các chủng nấm đột biến

Khả năng gây bệnh của các chủng nấm đột biến được đánh giá trên động vật mô hình là ấu trùng bướm G. mellonella bằng cách gây nhiễm trực tiếp Các ấu trùng bởi dịch bào tử theo quy trình đã được mô tả bởi Kelly and Kavanagh.

Các chủng nấm M. lusitanicus khác nhau bao gồm các chủng đối chứng (R7B) và các chủng đột biến (Δm2l1 và Δm2l2) được nuôi cấy trên môi trường đĩa thạch YPG pH 4,5 để thu bào tử. Bào tử được ly tâm (10 rpm trong 5 phút) và rửa 2 lần bằng đệm PBS với nồng độ bào tử được điều chỉnh phù hợp với từng thí nghiệm. Mật độ bào tử được tính toán sử dụng buồng đếm hồng cầu (Neubauer) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Ấu trùng G. mellonella được chọn cho thí nghiệm là những ấu trùng khỏe mạnh, nặng khoảng 250-350 mg, chiều dài đạt khoảng 2 cm. Ấu trùng được gây nhiễm nấm M. lusitanicus bằng cách tiêm trực tiếp dịch bào tử nấm qua vị trí chân giả cuối cùng bên trái với lượng tiêm 10 μL, sử dụng kim tiêm chuyên dụng. Các nhóm ấu trùng G. mellonella đối chứng gồm (1) nhóm ấu trùng không tiêm và (2) nhóm ấu trùng được tiêm 10 μL dung dịch đệm PBS. Ấu trùng sau khi tiêm được đặt trong các đĩa Petri đã khử trùng có lót giấy lọc Whatman ẩm, giữ trong bóng tối ở hai điều kiện nhiệt độ 26⁰C hoặc 30⁰C.

Để xác định được lượng bào tử M. lusitanicus gây nhiễm thích hợp cho thí nghiệm đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm, bào tử của chủng R7B với số lượng 5×10³, 10⁴ hoặc 10⁵ (bào tử/ mL) lần lượt được tiêm vào các nhóm ấu trùng G. mellonella khác nhau. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần với mỗi lần gồm 2 nhóm × 5 lô/nhóm × 10 ấu trùng/lô với 3 lô ấu trùng bị gây nhiễm và 2 lô đối chứng, nuôi ở 26⁰C và 30⁰C. Số lượng ấu trùng sống sót được theo dõi và ghi nhận tại mỗi 24h trong vòng 168h sau tiêm. Tỷ lệ ấu trùng sống sót (%) sau mỗi 24h được tính theo công thức sau:

Tỷ lệ sống sót (%) = (Số lượng ấu trùng còn sống sót/10) x 100%

Lượng bào tử gây nhiễm thích hợp được xác định là liều tiêm mà tại đó ít nhất 90% ấu trùng bị nhiễm nấm và chết (LD₉₀). Dịch phân lập từ mô vết bệnh (phần bị hóa đen) của các ấu trùng chết trong thí nghiệm được nuôi cấy trên đĩa thạch YPG pH 4,5. Ấu trùng được xác định bị nhiễm M. lusitanicus khi có sự xuất hiện của chủng R7B của loài nấm này trên môi trường phân lập.

Sau khi xác định được lượng bào tử gây nhiễm thích hợp, thí nghiệm đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm đột biến loại bỏ gen myosin II gồm Mc19 (Δm2l1) và Mc20 (Δm2l2) so với chủng đối chứng (R7B) được thiết kế và tiến hành theo quy trình đã nêu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và bước phân lập được tiến hành sau mỗi thí nghiệm trên các môi trường thích hợp để đảm bảo ấu trùng đã được gây nhiễm với đúng từng chủng nấm trong thí nghiệm.

3. Phương pháp xủ lý số liệu

Số liệu có được từ các thí nghiệm đánh giá các chỉ tiêu sinh trưởng và khả năng gây bệnh của các chủng nấm đột biến trong nghiên cứu này được lưu trữ, phân tích và minh họa bằng phần mềm Microsoft Excel và Orgin 2021. Kiểm định ANOVA hai chiều (p<0,05) cùng với phân tích Turkey được áp dụng để xử lý số liệu và xác định các sai khác có ý nghĩa thống kê.

4. Kết luận

Từ các kết quả nghiên cứu trên, có thể rút ra kết luận điều kiện thí nghiệm thích hợp nhằm đánh giá khả năng gây bệnh của nấm M. lusitanicus trên đối tượng ấu trùng G. mellonella với 10⁴ bào tử trong lượng dung dịch tiêm 10μL/ ấu trùng, điều kiện nhiệt độ 26⁰C. Kết quả này có thể được áp dụng trong các thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng gây bệnh nhiễm trùng vi nấm trên đối tượng động vật mô hình. Hướng nghiên cứu này sẽ tiếp tục được mở rộng với các loại nấm gây bệnh khác nhau nhằm có thể đưa ra khuyến cáo và hướng dẫn cho các nghiên cứu khác.