Trong những năm gần đây, công nghệ nano đang dần phổ biến với cuộc sống thường ngày. Những sản phẩm của công nghệ nano được ứng dụng ở nhiều lĩnh vực: dệt may, mỹ phẩm, công nghệ phần mềm, nông nghiệp, y dược, ... Ở kích thước nano, các tính chất vật lí, hóa học và sinh học của vật liệu khác biệt so với vật liệu có kích thước bình thường. Chính vì vậy, nhiều nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano để tạo ra các vật liệu có những tính mới này, trong đó là tạo ra các chất có khả năng tan trong nước và tính sinh khả dụng tốt từ những vật liệu bị hạn chế về những tính năng này đang là xu hướng hiện nay. Trong công nghệ tạo hạt nano, có hai nguyên lý chính được sử dụng: trên xuống (top-down) và dưới lên (bottom-up). Nhiều nghiên cứu chế tạo nano BBr với nhiều phương pháp khác nhau như: gắn BBr trên nano polymer, trên silica từ tính, trên lipid, gắn vào các dendrimer, graphene hay trên các nano vàng, nano bạc,… đã được công bố. Tuy nhiên, đa phần các nghiên cứu sử dụng phương pháp chế tạo từ dưới lên, hàm lượng BBr trong hệ nhỏ hơn 1% và quy trình chế tạo sử dụng các thiết bị hiện đại, không mang lại hiệu quả kinh tế và khó áp dụng vào sản xuất. Đối với các nguyên liệu sử dụng trong lĩnh vực dược phẩm, đặc biệt các hoạt chất hữu cơ, các hợp chất có cấu trúc tinh thể phương pháp nghiền bi với nguyên lý trên xuống thường được sử dụng. Vì berberin có cấu trúc tinh thể  nên trong nghiên cứu này phương pháp trên xuống được chọn để chế tạo hạt nano BBr.

Quần thể vi sinh vật trên mảng bám răng rất đa dạng và phong phú với hơn 300 loài đã được xác định, trong đó vi khuẩn Streptococcus mutans (S. mutans) được xem là tác nhân chính gây nên sâu răng. Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu tập trung vào hệ vi sinh vật trên mảng bám răng đặc biệt là S. mutans cũng như khảo sát, đánh giá các nguồn hợp chất hữu cơ, các chiết xuất thực vật có tác dụng kháng, ức chế hay tiêu diệt chúng. Berberin được xem là nguồn kháng sinh thực vật, cũng đã được chứng minh là có khả năng ức chế với các vi khuẩn gây bệnh trong miệng trong đó có S. mutans. Tuy nhiên, khả năng tan kém trong nước và tính sinh khả dụng thấp là hạn chế lớn nhất để ứng dụng berberin trong lâm sàng. Chính vì vậy, việc bào chế berberin thành dạng có kích thước nano nhằm khắc phục những hạn chế của berberin và mở ra nhiều tiềm năng ứng dụng cho berberin. Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích khảo sát và tối ưu tỉ lệ chất hoạt động bề mặt Tween 80: Sodium Laureth Sulfate (SLS) để tạo ra hệ nano berberin ổn định và đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn S. mutans của hỗn hợp nano berberin. Kết quả của đề tài sẽ là tiền đề định hướng ứng dụng hoạt chất nano berberin trong lĩnh vực chăm sóc răng miệng hiện nay.

1. Nguyên liệu

Berberin choloride 98%, Công ty Cổ phần Dược phẩm Novaco chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh ở A001, 36 Trịnh Đình Thảo, Phường Hoà Thạnh, Quận Tân Phú, TP.HCM.

Chủng vi khuẩn S. mutans ATCC®35668™ (Microbiologics, Hoa Kỳ) được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Trung tâm Nghiên cứu Triển khai Khu công nghệ cao, thành phố Hồ Chí Minh. Vi khuẩn được nuôi cấy tĩnh ở 37⁰C trong môi trường Trypton Soya Broth (TSB) (Scharlau, Tây Ban Nha) trong 24 giờ.

2. Phương pháp chế tạo nano berberin

Nano berberin được chế tạo bằng phương pháp nghiền bi Zirconium (95% ZrO₂, 5% Y₂O₃, hãng CZY – Hàn Quốc). Khảo sát tỉ lệ kết hợp giữa Tween 80 (Croda - Singapore) và SLS (PT BASF - Indonesia). Mỗi mẫu chứa 4% berberin, 200 gam bi Zirconium và định mức với nước vô trùng 100 mL. Mẫu được đặt trên máy quay trục lăn ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 120 giờ. Sau đó, mẫu được lọc loại bi và thu được hỗn hợp nano berberin.

3. Phương pháp xác định kích thước hạt nano berberin

Kích thước hạt nano được xác định bằng phân tích FE-SEM. Quy trình được tiến hành như sau: pha loãng các mẫu hỗn dịch nano berberin bằng nước cất. Sau đó, nhỏ giọt mẫu vào lưới đồng (3 mm), để khô ở nhiệt độ phòng và tiến hành phân tích FE - SEM (Hitachi S-4800, Nhật Bản).

4. Phương pháp xác định cấu trúc tinh thể của nano berberin

Cấu trúc tinh thể của nano berberin được xác định bằng phương pháp phổ nhiễu xạ tia X (XRD). Mẫu bột nano berberin được đông khô (CoolSafe, Canvac) trong 48 giờ ở -55⁰C trong điều kiện chân không. Sau khi đông khô, mẫu sẽ được phân tích XRD (ở góc quét từ 4-40°.

5. Phương pháp xác định hàm lượng berberin

Tiến hành dựng đường chuẩn: cân 10 mg berberine chloride (Sigma – Lot # SLCB1670) hòa tan hoàn toàn trong 10 mL methanol; từ dung dịch trên tiến hành pha loãng thành dãy nồng độ 0,5, 0,25, 0,1, 0,05 và 0,025 mg/mL. Độ hấp thụ được đo tại bước sóng cực đại đã xác định được trong quang phổ UV-Vis, methanol là dung dịch blank.

Xác định nồng độ berberin trong mẫu nano berberin: pha loãng mẫu hỗn dịch nano berberin trong methanol; tiến hành đo hấp thụ của dung dịch nano berberin pha loãng; xác định nồng độ berberin trong mẫu nano berberin dựa vào phương trình đường chuẩn đã dựng và tính hiệu suất thu hồi.

6. Phương pháp đánh giá khả năng kháng S. mutans của nano berberin

Khả năng kháng vi khuẩn S. mutans của nano berberin được xác định bằng phương pháp khuếch tán qua thạch và phương pháp pha loãng vi lượng. Đối với phương pháp khuếch tán qua thạch, chủng S. mutans được trải đều trên đĩa TSA với nồng độ 108 cfu/mL. Ống đục vô trùng (đường kính 5 mm) được dùng để đục tạo các giếng trên đĩa (5 giếng/đĩa); hút 100 μL dịch nano berberin ở các nồng độ 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1000 μg/mL và 2000 μg/mL cho vào giếng với đối chứng âm là nước cất vô trùng và đối chứng dương là ampicillin 1μg/mL; ủ các đĩa ở 37ºC, sau 48 giờ ghi nhận vòng vô khuẩn ở các nghiệm thức. Đối với phương pháp pha loãng vi lượng, pha loãng bậc 2 hỗn hợp nano berberin trong môi trường TSB từ nồng độ 5000 μg/mL; tiếp tục bổ sung dịch khuẩn vào các nghiệm thức để đạt nồng độ cuối là 108 cfu/mL, nghiệm thức đối chứng là ống nghiệm không chứa nano berberin. Các nghiệm thức được ủ ở 37ºC. Sau 24 giờ, 100 μL hỗn dịch được hút trải đều trên môi trường TSA. Các đĩa được ủ ở 37ºC, sau 48 giờ ghi nhận số lượng khuẩn lạc hiện diện trên các đĩa và tính hiệu suất diệt khuẩn theo công thức:

H (%) = (A-B)/A x 100

Trong đó:

H (%): Hiệu suất diệt khuẩn ở mốc thời gian xác định.

A (cfu/mL): số tế bào vi khuẩn trong 1 mL ở nghiệm thức đối chứng.

B (cfu/mL): số tế bào vi khuẩn trong 1 mL ở nghiệm thức thử nghiệm.

7. Kết luận

Trong nghiên cứu này, tỉ lệ chất hoạt động bề mặt Tween 80 : SLS là 3 : 1 sẽ tạo ra hệ nano ổn định và tạo ra hạt nano berberin có cấu trúc đồng nhất về kích thước từ 40 - 65 nm. Hệ nano phân tán tốt trong nước, cải thiện tính tan và tính sinh khả dụng của dược liệu berberin, nâng cao tiềm năng ứng dụng. Nano berberin có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của vi khuẩn S. mutans. Với nồng độ 19,53% ức chế hơn 80% sự phát triển và nồng độ 78,13 μg/mL trở lên gần như ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn. Những kết quả này cho thấy nano berberin có tiềm năng tạo các chế phẩm ứng dụng để kiểm soát vi khuẩn S. mutans – tác nhân chính gây sâu răng.