Tôm khỏe vẫn có khả năng nhiễm bệnh AHPND khi tiếp xúc với tôm nhiễm AHPND trước đó đã được trữ ở -80°C. Nhiều kết quả nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả sử dụng thảo dược trong phòng trị bệnh thủy sản. Hoạt tính kháng khuẩn của các chiết xuất thảo dược cho đến nay là hoạt tính sinh học được nghiên cứu nhiều nhất, với nhiều tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản. Các hợp chất được tìm thấy trong các chiết xuất thảo dược có khả năng kháng khuẩn bao gồm: alkaloids, glycosides, polyphenols và terpenes. Sử dụng thảo dược mang đến nhiều lợi ích: ít tốn kém khi sử dụng nguyên liệu thảo dược thô, có sẵn tại địa phương, dễ dàng chuẩn bị, dễ dàng bị phân hủy sinh học và không gây tác động bất lợi cho môi trường. 
Thời gian gần đây, chất chiết thảo dược giúp tăng khả năng kháng vi khuẩn Vibrio và tăng cường đáp ứng miễn dịch của  tôm  nuôi đã được nghiên cứu. Chất chiết xuất cây lựu (Punica granatum), cây diệp hạ châu (Phyllanthus spp.), cây bàng (Terminalia catappa), cây thầu dầu (Ricinus communis L.) đã được xác định hiệu quả phòng bệnh trên tôm thông qua các thí nghiệm in-vitro và in-vivo. Một số loài thực vật khác như bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis), ổi (Psidium guajava), hồng sim (Rhodomyrtus tomentosa) và trâm mốc (Syzygium cumin) cũng đã được xác định hiệu quả giúp giảm tỷ lệ chết của tôm khi gây cảm nhiễm với vi khuẩn Vibrio. 
Tất nhiên, kết quả trên phụ thuộc vào phương pháp chiết xuất và nồng độ sử dụng trong thức ăn của tôm. Dung môi hữu cơ hoặc cồn có hiệu quả trong chiết xuất các hợp chất chuyển hóa sinh học thứ cấp (phân cực hoặc không phân cực) với hoạt tính kháng khuẩn và kích thích miễn dịch so với chiết xuất bằng nước. Ở liều tối ưu giúp kích hoạt đáp ứng miễn dịch tối đa và ở liều cao có thể không tăng cường hoặc thậm chí ức chế đáp ứng miễn dịch. Thời gian bổ sung thảo dược cũng là một trong những yếu tố tác động đến khả năng đáp ứng miễn dịch của tôm và cá.

Cây giấm (hay còn được gọi là bụp giấm) là loài thực vật hoang dã ở khu vực ven biển của Việt Nam. Chúng có thể sống được những vùng đất ngọt và lợ-mặn. Cây giấm có khả năng  sát trùng, lợi tiểu, chống oxy hóa. Cây giấm có các thành phần hóa học  như  gogoetine,  hibiscin (anthocyanin), glucoside hibiscritin (flavanol), riboflavin, axit ascorbic, niacin, caroten, canxi và sắt. Các báo cáo trước đây cho thấy chất chiết từ cây giấm có hoạt tính kháng cả vi khuẩn Gram âm (V.  vulnificus,  Aeromonas hydrophila, A. caviae, Escherichia coli, Salmonella enteric, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris và Pseudomonas aeruginosa) và vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. mutansvà Bacillus cereus). Tuy nhiên, cho đến nay, vẫn chưa có các kết quả nghiên cứu toàn diện về hiệu quả của cây giấm trên đối tượng thủy sản. Cụ thể như khả năng kháng vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên tôm, khả năng kích thích tăng trưởng, tăng cường miễn dịch và chống lại vi khuẩn gây bệnh trên tôm. Bài viết này là kết quả đánh giá hiệu quả của chiết xuất lá cây giấm lên khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính  trên tôm thẻ, đồng thời đánh giá tốc độ tăng trưởng và khả năng đáp ứng miễn dịch trên tôm thẻ thí nghiệm.

1. Nguyên liệu lá cây giấm và phương pháp chiết xuất

Lá cây giấm (Hibiscus sabdariffa) được thu 3 đợt ở các vị trí khác nhau tại tỉnh Trà Vinh. Mẫu lá được rửa sạch, sấy ở 50⁰C đến khô và sau đó được nghiền thành bột. Bột được sử dụng để chiết xuất với ba loại  dung  môi khác nhau.

Phương pháp 1 (chiết xuất với  dung  môi methanol): Bột từ lá cây giấm  được ngâm trong dung môi methanol với tỉ lệ 1:10 trong 4 ngày. Sau đó hỗn hợp được lọc thô qua vải và tiếp tục được lọc qua giấy lọc Whatman No.1. Dung dịch qua lọc được cô quay chân không với tốc  độ quay 150 vòng/phút ở nhiệt  độ 50⁰C, để loại bỏ dung môi. Sản phẩm sau cô quay được sấy ở 50⁰C để loại bỏ hoàn toàn dung môi. Chất chiết sau cùng được lưu trữ ở 4⁰C.

Phương pháp 2 (chiết xuất với dung môi ethanol): Quy trình tương tự như đối với dung môi methanol. Ngâm bột lá cây giấm  trong  dung  môi ethanol với tỉ lệ 1:10 trong 4 ngày. Hỗn hợp được lọc qua vải và giấy lọc Whatman No.1. Dung dịch qua lọc được cô quay chân không 150 vòng/phút ở 50⁰C. Trước khi được lưu trữ ở 4⁰C, chiết xuất cũng được sấy ở 50⁰C cho đến khi khối lượng không đổi.

Phương pháp 3 (chiết xuất với với nước nóng): Ngâm 10 g bột cây giấm với 150  mL  nước (tỉ lệ 1:15). Hỗn hợp được đun ở nhiệt độ 100⁰C đến khi dịch chiết còn lại khoảng 10 mL. Chiết xuất được bảo quản ở 4⁰C.

2.  Thí nghiệm in-vitro xác định hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết

Thí nghiệm được tiến hành bằng cách chuẩn bị đĩa tẩm chất chiết xuất và dung dịch huyền phù vi khuẩn V. paraheamolyticus. 0,8 g mỗi loại chất chiết lá cây giấm  được hòa tan trong 2 mL dung dịch DMSO (Dimethyl sulfoxide). Dung dịch chất chiết (50 µL) được nhỏ từ từ lên một đĩa giấy có đường kính 8 mm (Advantec, New Zealand). Các đĩa giấy được làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Dụng cụ và thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng.

Thí nghiệm sử dụng dòng vi khuẩn V.paraheamolyticus được phân lập và định danh từ nghiên cứu trước đây được lưu trữ tại phòng thí nghiệm bệnh học của Trường Đại học Trà Vinh. Dòng vi khuẩn này được kiểm tra độc lực gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính bằng kỹ thuật PCR trước khi được nuôi tăng sinh  trong  môi  trường TSB (Tryptic Soy Broth, Himedia, Ấn Độ), có bổ sung 1,5% NaCl trong 18-24 giờ để thu dung dịch huyền phù.

2.1. Đo đường kính vòng kháng khuẩn

Khả năng  kháng  khuẩn của chiết xuất lá cây giấm được xác định bằng cách đo đường kính của vòng kháng khuẩn Oonmetta-aree. Dùng tăm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch huyền phù vi khuẩn V. paraheamolyticusvới mật số 108CFU/mL và tán đều lên bề mặt đĩa môi trường TSA (Tryptone Soya Agar) có bổ sung 1,5% NaCl. Sau đó, các đĩa giấy đã được tẩm chất chiết được đặt lên đĩa  môi  trường đã được trải vi khuẩn. Các đĩa tẩm DMSO (dimethyl sulfoxide) được sử dụng làm đối chứng âm và đĩa kháng sinh doxycyclin (DOX, 30 μg) làm đối chứng  dương. Các đĩa môi trường TSA được ủ ở 35°C trong 24 giờ. Đo  đường kính vòng kháng khuẩn xuất hiện trên các đĩa môi trường TSA. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Từ số liệu đường kính vòng kháng khuẩn, khả năng  kháng  khuẩn của chất chiết  được phân thành các loại: kháng, trung bình, nhạy. Cụ thể, chất chiết có khả năng kháng khuẩn khi đường kính vòng kháng khuẩn ≤ 9 mm, tính kháng trung bình khi đường kính khoảng 10 - 13 mm và tính kháng nhạy khi đường kính ≥ 14 mm.

2.2. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (minimum inhibitory concentration – MIC) và nồng  độ diệt khuẩn tối thiểu (minimumbactericidal concentration -MBC)

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu

Mỗi chiết xuất thảo dược được pha loãng với DMSO thành các tỉ lệ 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512,  1:1024,  1:2048.  Tương ứng với mỗi độ pha loãng, 1 mL dịch chiết được cho vào môi trường lỏng TSB-1,5% NaCl có chứa sẵn 1 mL dịch huyền phù vi khuẩn V. parahaemolyticus với mật số 2×106CFU/mL. Hỗn hợp được ủ ở 35⁰C trong 24 giờ. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Giá trị MIC cần xác định là nồng  độ thấp nhất của chiết xuất có khả năng không cho vi  khuẩn phát triển trong môi trường lỏng.

Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

Dịch huyền phù (50 µL) của thử nghiệm MIC được trải  lên  môi  trường thạch TCBS agar (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar). Mỗi chất chiết được lặp lại 3 lần và tương ứng mỗi độ pha loãng. Đĩa thạch được ủ ở 35⁰C trong 24 giờ. Giá trị MBC của chiết xuất thảo dược được xác định là nồng độ thấp nhất không có vi khuẩn phát triển trên bề mặt đĩa thạch.

2.3.  Đánh giá tác động của chất chiết lá cây giấm lên sinh trưởng và phát triển của tôm thẻ chân trắng

a. Chuẩn bị nguyên vật liệu

Tôm được thí nghiệm là tôm thẻ chân trắng ở giai  đoạn Postlarvae 15 (âm tính với bệnh  đốm trắng, bệnh vi bào tử trùng và bệnh hoại tử gan tụy cấp  tính). Tôm được nuôi trong ao tại trại thực nghiệm Khoa Nông nghiệp - Thủy sản, Trường Đại học Trà Vinh  đến khi tôm đạt kích cỡ  khoảng 10,54±0,39  g/con  và chiều dài  11,61±0,23  cm. Trước khi bố trí vào các bể nuôi thí nghiệm, tôm được kiểm tra âm tính với mầm bệnh đốm trắng và AHPND sử dụng phương pháp PCR với đoạn mồi đặc hiệu và chu trình  nhiệt. Tôm cũng được thuần dưỡng trong 3 ngày để quen với điều kiện môi trường trong bể nuôi trước khi bắt đầu quá trình cho ăn thử nghiệm.

Nguồn  nước sử dụng cho thí nghiệm là nước biển với độ mặn 28‰ ở xã Ba Động, huyện Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh. Nước biển được lọc qua túi lọc, sau đó được khử trùng với chlorin với nồng độ 20 -30 mg/L. Tiếp theo, nước được sục khí mạnh và liên tục trong 24 giờ, và được trung hòa Cl tự do bằng Na₂S₂O₃ (tỉ lệ Na₂S₂O₃:Cl là 7:1). Nước mặn 28‰ sau khi được xử lý xong thì được pha loãng với nước ngọt để có độ mặn 15‰.

Bổ sung chất chiết lá giấm vào thức ăn: Viên thức ăn tôm với 40% đạm (Công ty chăn nuôi CP, Việt Nam) được áo bên ngoài với chất chiết lá cây giấm với các nồng độ 1%, 1,5% và 2%. Sau đó, viên thức ăn tiếp tục  được áo thêm 2% dầu mực (Vemedim, Việt Nam). Viên thức ăn được bảo quản ở 4⁰C để sử dụng cho thí nghiệm. Đối với nghiệm thức đối chứng, viên thức ăn chỉ được áo với 2% dầu mực.

2.3.2. Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm sử dụng bể composite 500 L có sục khí với mật độ 60 con/bể, độ mặn nước 15‰. Thí nghiệm được bố trí với 4 nghiệm thức với 3 lần lặp lại. Cụ thể, nghiệm thức đối chứng tôm thí nghiệm được cho ăn thức ăn viên 40% đạm (Công ty Chăn nuôi  CP,  Việt  Nam)  không  bổ sung chiết xuất lá giấm, 3 nghiệm thức còn lại tôm ăn thức ăn được bổ sung 1%, 1,5% và 2% chiết xuất methanol từ lá cây giấm. Tôm thí nghiệm ăn 4 lần/ngày: 7 giờ, 11 giờ, 15 giờ và 21 giờ. Lượng thức ăn theo nhu cầu của tôm,  khoảng 7-10% khối  lượng thân. Thí nghiệm cho ăn được thực hiện trong thời gian 30 ngày. Theodõi hoạt động,  lượng thức ăn tôm ăn vào để điều chỉnh lượng thức ăn cho phù hợp và thay nước 30% mỗi ngày bằng cách shiphon.

2.3.3. Chỉ tiêu theo dõi

Các thông số môi trường như pH, nhiệt độ, NH₃, NO₂^- được theo dõi mỗi ngày 1 lần bằng bộ test kit Sera. Nhiệt độ được đo bằng nhiệt kế. Chiều dài và khối  lượng của  tôm  thí  nghiệm được ghi nhận mỗi 10 ngày và thực hiện trong 30 ngày thí nghiệm. Cụ thể, 5 con tôm/bể được bắt ngẫu nhiên để cân khối lượng và đo chiều dài, đánh giá tăng tưởng của tôm ở các nghiệm thức ăn thức ăn có bổ sung chất chiết lá giấm.

Đánh giá sự tác động của chất chiết đến khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu trên tôm thẻ chân trắng. Cụ thể, tôm thẻ chân trắng được thu mẫu máu để tiến hành xác định chỉ số huyết học. Máu tôm được thu vào các ngày: ngày đầu tiên (trước khi bố trí thí nghiệm), ngày thứ 15 và ngày thứ 30 (ngày kết thúc thí nghiệm) với số lượng  3  con  tôm/bể.

Phương pháp xác định tổng số tế bào máu (THC) được thực hiện theo phương pháp của Le Moullac et al. và định loại bạch cầu (GC và HC) theo mô tả của Cornick and Stewart.

2.4.  Phương pháp xử lý số liệu

Tổng hợp số liệu thí nghiệm được thực hiện trên phần mềm Microsoft Office Excel 2010. Sử dụng phần mềm SPSS 20.0 để kiểm tra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) bằng phép thử Duncan.

3. Kết luận

Chất chiết lá cây  giấm sử  dụng  dung  môi methanol có hoạt tính kháng khuẩn cao (đường kính vòng vô khuẩn trung bình là 24 mm). Chất chiết này có khả  năng ức chế  và tiêu diệt vi khuẩn V. parahaemolyticus (MIC là 0,02 mg/mL, MBC là 0,08 mg/mL). Khi bổ sung 1%, 1,5% và 2% chất chiết lá cây giấm vào thức ăn, tôm thẻ chân trắng có sự tăng trưởng về chiều dài và khối lượng nhiều hơn so với tôm không được bổ sung sau 30 ngày cho ăn liên tục. Đồng thời, liều lượng 1 và 1,5% có hiệu quả trong việc cho nâng cao đáp ứng miễn dịch của tôm, thể hiện qua sự gia tăng số lượng bạch cầu không hạt (HC).

Chất chiết lá cây giấm có tiềm năng lớn được sửdụng với vai trò là chất diệt khuẩn  đối với  V. parahaemolyticus. Đồng thời, chất này thích hợp là chất bổ sung vào thức ăn giúp cải thiện tăng trưởng, tăng cường miễn dịch của tôm.