Sự thiếu hụt cơ sở dữ liệu về đặc điểm sinh học sinh sản, sự hao hụt lớn về số lượng do hiện tượng ăn lẫn nhau trong giai đoạn cá giống là những nguyên nhân chính dẫn đến việc chủ động nguồn giống cá Leo gặp nhiều khó khăn. Thành công của việc sinh sản nhân tạo cá Leo đã được các nghiên cứu trong và ngoài nước công bố. Tuy nhiên, các kết quả này chưa được mô tả cụ thể về mức độ thành thục, kích thước đường kính trứng cá, khoảng cách giữa nhân đến màng tế bào, thời điểm tiêm chất kích thích hay nguồn gốc của các loại hormone, đây là những yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến kết quả sinh sản. Đối với cá được nuôi trong ao do điều kiện sinh thái không thích hợp để cá có thể sinh sản tự nhiên, nên phải tiêm các chất kích thích sinh sản vào cơ thể cá làm thay đổi hoạt động nội tiết của trục não bộ - tuyến yên - tuyến sinh dục nhằm kích thích cá bố mẹ rụng trứng và phóng tinh. Trong các loại chất kích thích sinh sản sử dụng cho cá, HCG là hormone được dùng phổ biến và có hiệu quả cho nhiều loài cá với liều lượng tiêm dao động từ 500 – 5.000 IU/kg cá cái. Nồng độ HCG tiêm cho cá phụ thuộc vào mức độ tinh khiết của chế phẩm cũng như sự thành thục của cá.

Trong nghiên cứu này, ngoài các tiêu chí lựa chọn về ngoại hình, độ tuổi của cá, chỉ tiêu kích thước đường kính trứng, sự lệch nhân của tế bào trứng cũng được đánh giá để đảm bảo tính đồng nhất của cá thí nghiệm. Mặt khác, khi sử dụng chất kích thích sinh sản phù hợp sẽ giúp cá đẻ đồng loạt, đẻ róc và các chỉ tiêu sinh sản như: tỉ lệ rụng trứng, tỉ lệ trứng thụ tinh, tỉ lệ nở cao và hiệu quả hơn so với việc không dùng chất kích thích.

Trên cơ sở đó, mục tiêu của nghiên cứu này nhằm xác định liều lượng hormone HCG phù hợp để kích thích quá trình chín, rụng trứng và theo dõi quá trình phát triển phôi của cá Leo làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng qui trình sản xuất giống nhân tạo phục vụ mục tiêu đa dạng hóa đối tượng nuôi nước ngọt ở tỉnh Thừa Thiên Huế và khu vực miền Trung.

1. Vật liệu nghiên cứu

Thí nghiệm sử dụng 18 cá cái và 9 cá đực sau khi nuôi vỗ đã thành thục (cá cái có khối lượng trung bình 2,15 ± 0,11 kg/con, chiều dài 60,4 ± 3,24 cm/con; cá đực có khối lượng trung bình 1,57 ± 0,08 kg/con, chiều dài 53,3 ± 2,41 cm/con) được lựa chọn để tiến hành thí nghiệm. Tất cả cá cái được đánh dấu bằng phương pháp gắn microchip i-Tag162s for fish của hang BTS-ID® RFID và scan kiểm tra IDnumber bởi thiết bị Microchip reader R-540 – Handheld (Sản xuất tại Đức) trước khi đưa vào thí nghiệm. Cá Leo đực và cái được đưa vào các bể composite dạng hình tròn (dung tích 1,0 m³ và chỉ cấp nước 0,7 m3/bể) nhốt riêng trước khi tiêm. Chất kích thích được sử dụng trong nghiên cứu này là HCG (Sigma, USA). Trước khi tiêm, cá được gây mê bằng Aqui-S® với nồng độ 5 ml/m3 (Sản xuất tại công ty Bayer VN); khi cá chuyển sang trạng thái mê, vớt cá ra để trên khăn ẩm (tránh mất nhớt) và tiến hành tiêm.

2. Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm kích thích sinh sản cá Leo bằng HCG được tiêm cho cá cái với năm nghiệm thức ở các liều tiêm 1.000 IU/kg, 2.000 IU/kg, 3.000 IU/kg, 4.000 IU/kg, 5.000 IU/kg và nghiệm thức đối chứng (ĐC) không tiêm HCG (chỉ tiêm nước muối sinh lý). Ở mỗi liều tiêm được tiến hành lặp lại trên 3 cá cái. Cá cái được tiêm 2 lần, liều sơ bộ tiêm lượng HCG bằng 1/3 tổng liều tiêm và sau 24 giờ sẽ tiến hành tiêm liều quyết định. Cá cái sau khi tiêm được nuôi nhốt riêng từng nghiệm thức/bể (cá đã được đánh dấu bằng phương pháp gắn microchip) để theo dõi các chỉ tiêu nghiên cứu. Cá đực được tiêm HCG với nồng độ 1.500 IU/kg, tiêm cùng lần với liều quyết định cá cái (thể tích dung môi để tiêm cho 1 kg cá là 0,3 mL).

Cá cái sau khi tiêm được giữ trong bể composite theo từng nghiệm thức riêng (03 cá cái/nghiệm thức/bể) và duy trì nhiệt độ nước 28 – 29⁰C, pH 7,2 - 7,3, DO 5,1 - 5,4 mg/L. Trong vòng 24 giờ kể từ khi tiêm liều quyết định, tiến hành kiểm tra độ chín muồi và rụng trứng bằng cách vuốt nhẹ bụng cá cái. Nếu trứng chảy ra thì tiến hành vuốt trứng cho thụ tinh nhân tạo bằng cách mổ cá đực để lấy túi tinh thụ tinh cho trứng (trứng của mỗi cá cái được vuốt riêng ra một bát xứ). Buồng tinh của mỗi cá đực được sử dụng để thụ tinh với trứng của hai cá cái.

Trong thí nghiệm này, trứng sau khi thụ tinh cho dính vào giá thể. Giá thể làm bằng lưới nilon căng trên một khung nhựa hình vuông, mỗi cạnh dài 40 cm. Đặt giá thể ngập 3 - 5 cm trong nước và rãi đều trứng đã thụ tinh lên. Khung ấp trứng đặt trong bể composite dạng hình tròn (dung tích 1,0 m³ và chỉ cấp nước 0,7 m³/bể) có lắp sục khí nhẹ (duy trì DO > 5 mg/L). Để tính số lượng trứng cần ấp cho mỗi khung giá thể, trong nghiên cứu này đã tiến hành thu ngẫu nhiên 1 gam trứng/mẫu (lặp lại 3 lần) rồi đếm tổng số trứng trên mỗi gam (trung bình 250 trứng/gam); mỗi khung ấp được 40 gam, tương ứng với mật độ 10.000 trứng/khung giá thể.

3. Xác định kích thước và sự lệch nhân của tế bào trứng

Xác định đường kính trứng áp dụng phương pháp sinh thiết (biopsy), sử dụng que thăm trứng bằng nhựa mã REF-1103000 của hãng Laboratoire CCD (Sản xuất tại Pháp) để thu trứng của cá từ buồng trứng (3 cá cái/nghiệm thức). Trứng thu được giữ trong dung dịch Ringer (120 mM NaCl; 5 mM KCl; 3,5 mM CaCl₂; 3,5 mM MgSO₄; 3 mM NaH₂PO₄; 10 mM HEPES; pH 7,4) để đo kích thước trứng (30 trứng/cá cái) bằng kính hiển vi gắn với trắc vi thị kính (Kruss optronic, Đức).

Ngoài ra, 6 tế bào trứng khác trên mỗi cá thể được thu thập ngẫu nhiên và ngâm trong dung dịch Serra (ethanol, formalin và axit axetic được pha với tỉ lệ 6:3:1 theo thể tích) để xác định vị trí của nhân theo phương pháp của Stoeckel (2000). Sau khoảng 10 – 15 phút, nhân của tế bào trứng sẽ được nhìn thấy rõ ràng, khoảng cách giữa tâm nhân và màng của tế bào trứng được đo bằng kính hiển vi (quan sát dưới vật kính 4X) gắn với trắc vi thị kính để đánh giá các giai đoạn trưởng thành của tế bào trứng.

4. Xác định đặc điểm phát triển của phôi cá Leo

Quá trình phát triển phôi gồm 2 giai đoạn: (i) Giai đoạn phát triển bên trong trứng gồm có 6 giai đoạn phụ: Giai đoạn thụ tinh, giai đoạn trứng phân cắt, giai đoạn phôi nang, giai đoạn phôi vị, giai đoạn hình thành các cơ quan và giai đoạn trứng nở; (ii) Giai đoạn phát triển bên ngoài trứng: Là giai đoạn sau khi nở đến khi kết thúc dinh dưỡng bằng noãn hoàng.

5. Các chỉ tiêu theo dõi

(1) Thời gian hiệu ứng: Tính từ khi cá được tiêm liều quyết định đến khi cá rụng trứng.

(2) Tỉ lệ thụ tinh (tính khi trứng phát triển đến giai đoạn phôi vị):

Tỉ lệ thụ tinh (%) = Số trứng ở giai đoạn phôi vị/ Số trứng đem ấp x 100

(3) Tỉ lệ nở:

Tỉ lệ nở (%) = Tổng số cá mới nở/ Tổng số trứng được thụ tinh x 100

(4) Năng suất cá bột (NSCB):

NSCB (vạn/kg) = Tổng số cá bột (vạn)/ Tổng khối lượng của cá cái tham gia đẻ (kg)

(5) Tỉ lệ dị hình:

Tỉ lệ dị hình (%) = Số lượng cá bị dị hình (con)/ Số lượng cá bột thu được (con) x 100

(Dấu hiệu cá bị di hình: cá cong thân, gù lưng, vẹo cột sống, dị tật trên tia vây)

6. Xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excel 2016 và SPSS (phiên bản 20.0 cho Windows). Kiểm định thống kê được thực hiện ở mức ý nghĩa p < 0,05, bằng phép thử Tukey. Phần mềm Graphpad Prism phiên bản 9.0 dành cho Windows được sử dụng để vẽ các biểu đồ.

7. Kết luận

Kích thước đường kính trứng của cá Leo đạt 1,67 - 1,71 mm và nhân tế bào trứng cá di chuyển từ trung tâm ra màng tế bào trứng là cá có thể tham gia sinh sản. Hormone HCG có tác dụng gây rụng trứng trên cá Leo đã thành thục. Sử dụng HCG với liều tiêm 3.000 – 4.000 IU/kg cá cái cho tỉ lệ rụng trứng, tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ nở và năng suất cá bột đạt yêu cầu sản xuất giống.

Thời gian phát triển phôi của cá Leo dao động từ 18 đến 20 giờ. Cá mới nở dinh dưỡng bằng noãn hoàng, sau khoảng 2,5 – 3 ngày cá tiêu hết noãn hoàng và bắt đầu sử dụng thức ăn bên ngoài.