Bệnh đốm đen trên tôm thẻ chân trắng do nấm Fusarium solani gây ra, bệnh gây chết hàng loạt tôm thẻ ở giai đoạn nuôi thương phẩm. Tôm nuôi ở Việt Nam thường hay bị bệnh đen mang, một trong những nguyên nhân chính là do nấm Fusariumvà từ những ao tôm bị bệnh đen mang, đã phân lập được loài nấm Fusarium incarnatum, Fusarium solani. Nấm Fusarium, thuộc lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Nectriaceae, đây là loài nấm phổ biến, có phân bố trên toàn thế giới, được tìm thấy trong thực vật, đất, nước ngọt, và nước lợ, mặn. Nấm Fusarium có thể gây ra nhiều bệnh ở động vật và thực vật trên toàn thế giới, làm giảm năng suất nuôi trồng.

Hóa chất thường được sử dụng để phòng trị bệnh do nấm gây ra như povidoneiodine, nước  oxy già và formalin. Tuy nhiên bệnh do nấm Fusarium solani gây ra trên tôm thẻ chân trắng thường rất khó điều trị dứt điểm vì chúng sinh sản nhanh và tốc độ lây lan lớn. Nano bạc là một trong những giải pháp thay thế một số loại thuốc phòng trị bệnh trên tôm. Nano bạc ức chế trực tiếp sự phát triển của sợi nấm, sự nảy mầm của bào tử nấm và phá vỡ màng tế bào nấm. Nano bạc làm giảm hoạt tính của các enzyme bảo vệ tế bào, ức chế quá trình vận chuyển oxy vào trong tế bào và phá hủy màng tế bào nấm Fusarium graminearum.

Do đó, nghiên cứu này được tiến hành nhằm phân lập nấm Fusarium solani trên tôm thẻ chân trắng bị bệnh đốm đen và thử nghiệm khả năng kháng nấm của nano bạc trong điều kiện in vitro.

1. Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và định danh nấm Fusarium solani trên tôm thẻ chân trắng bị bệnh đốm đen.

- Thử nghiệm khả năng kháng nấm Fusarium solani của nano bạc.

2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Tôm thẻ chân trắng có các đốm đen trên mang, trên vỏ kitin và còn sống. Mỗi ao thu 10 con, tổng số mẫu tôm thu để nuôi cấy, phân lập nấm là 30 con. Tôm có chiều dài trung bình là 12,4 cm và khối lượng trung bình là 11,8 g/con. Tôm được đóng trong thùng xốp, có sục khí và vận chuyển sống về phòng thí nghiệm Bệnh thủy sản, Khoa Thủy sản Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế để kiểm tra và phân lập nấm.

Môi trường Peptone Yeast-extract Glucose Salt Agar (PYGS agar- gồm peptone 1,25 g,  yeast - extract 1,25 g, glucose 3 g, agar 12 g, muối NaCl 30 g và 1000 mL nước cất); Peptone Yeast-extract Glucose Salt (PYGS); môi trường nước muối vô trùng (30 g muối  NaCl và 1000 mL nước cất); nước muối sinh lý (0,85% NaCl); kháng sinh Ampicillin và Streptomycin (Mekophar, Việt Nam); nano bạc có kích thước 14 nm được cung cấp bới Nanografi (Đức)

2.2. Phương pháp phân lập và định danh nấm

Phân lập nấm trên tôm thẻ chân trắng được tiến hành và dùng kéo tiệt trùng bằng cồn 96⁰ để cắt mẫu từ vị trí bị đốm đen trên tôm, rửa nhẹ 03 lần qua nước muối sinh lý vô trùng và cấy trên môi trường PYG Sagar có bổ sung 2mg mỗi loại kháng sinh Ampicillin và Streptomycin xung quanh mẫu bệnh phẩm để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn. Nuôi cấy  từ 1- 4 ngày ở nhiệt độ 28⁰C và cấy chuyền 2 - 3 lần sang môi trường PYGS agar để thu được khuẩn lạc nấm thuần. Sau đó cắt phần đầu của khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trường PYGS, để ở nhiệt độ 28⁰C sau 24 - 48 giờ, quan sát sự phát triển của sợi nấm. Cắt sợi nấm từ môi trường trên rửa 3 lần qua nước muối  sinh  lý vô trùng và nuôi cấy trong môi trường nước muối vô trùng ở nhiệt độ 28⁰C, sau 24 - 48 giờ quan sát sự sinh bào tử của nấm và tiến hành thu bào tử để nuôi cấy thuần chủng trên môi trường PYGS agar.

Phương pháp nuôi cấy tiêu bản được tiến hành: Dùng dao vô trùng cắt một khối môi  trường PYGS agar có kích thước khoảng 7x7x7 mm và đặt trên lam kính vô trùng. Đặt lamen này  trong đĩa peptri vô trùng, gác trên một que thuỷ tinh, bên dưới có lớp giấy thấm giữ ẩm. Cấy bào tử nấm hay sợi nấm vào 4 mặt bên của khối agar và đậy đĩa peptri lại. Ủ đĩa cấy ở nhiệt độ 28⁰C trong 24 - 48 giờ. Sau khi nấm và bào tử nấm phát triển trên khối agar, lấy lamen ra và quan sát dưới kính hiển vi để xác định hình dạng của sợi nấm, bào tử và hình thức sinh sản. Tiến hành phân loại nấm dựa vào hình dạng và kích thước của khuẩn lạc, hình dạng sợi nấm và bào tử nấm và định danh theo khóa phân loại

2.3. Phương pháp xác định khả năng kháng nấm Fusarium solani của nano bạc

Thử nghiệm khả năng kháng nấm của nano bạc trên môi trường nuôi cấy được thực hiện. Nồng độ nano bạc ban đầu được pha loãng là 20 µg/mL bằng cách bổ sung nano bạc  vào môi  trường  PYGS  sau  khi  hấp  ở nhiệt độ 121⁰C trong 15 phút; sau đó pha các nồng độ tiếp theo theo tỷ lệ 1:1; 1:2 và 1:4 (tương ứng lần lượt với các nồng độ 10; 5 và 2,5 µg/mL). Cắt viền ngoài của khuẩn lạc nấm, cho vào đĩa peptri chứa 20 mL môi trường PYGS có các nồng độ nano bạc đã pha loãng như trên, ngâm trong 15; 30 và 60 phút, sau đó rửa nhẹ khuẩn lạc nấm trong nước muối sinh lý vô trùng (0,85% NaCl) và cấy trên môi trường PYGS agar. Khuẩn lạc nấm ngâm trong môi trường PYGS không bổ sung nano bạc trong thời gian như trên được sử dụng làm lô đối chứng và mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần. Nấm được nuôi cấy ở nhiệt độ 28⁰C, quan sát sự phát triển của nấm và đo đường kính khuẩn lạc của nấm hàng ngày trong 14 ngày thực hiện thí nghiệm.

2.4. Xử lý số liệu

Số  liệu  được  xử  lý  trên  phần  mềm Microsoft Excel 2016 và SPSS 20, trong đó sử dụng phân tích phương sai ANOVA một nhân tố để so sánh giá trị trung bình theo phương pháp Tukey với độ tin cậy 95%.

3. Kết luận

Nghiên cứu đã phân lập được chủng nấm Fusarium solanitrên các mẫu tôm thẻ chân trắng bị bệnh đốm đen nuôi tại Phú Lộc, Thừa Thiên Huế. Kết quả xác định khả năng kháng nấm Fusarium solani của nano bạc trong điều kiện  in vitrocho thấy nano bạc có khả năng kháng  nấm  Fusarium solaniở nồng độ 20 µg/mL khi ngâm trong thời gian  từ 15 đến 60 phút.  Nano  bạc  ở nồng 2,5; 5 và 10 µg/mL đều có khả năng ức chế sự phát triển của nấm, đường kính khuẩn lạc nấm Fusarium solanikhi ngâm ở các nồng độ này trong thời gian 15; 30 và 60 phút đều thấp hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với đối chứng.