Một số loài nấm và vi khuẩn có khả năng sản sinh nhiều nhóm enzyme, chúng hỗ trợ lẫn nhau để thủy phân mối liên kết β-1,4-D-glucoside trong phân tử cellulose. Sản xuất amylase và cellulase thông qua quá trình lên men môi trường bán rắn (môi trường xốp) bằng cách sử dụng kết hợp loài A. oryzae vàTrichoderma reesei. Việc nuôi cấy đồng thời Aspergillus-Streptomyces trong cùng môi trường để tạo ra các hoạt chất sinh học. Việc sản xuất cellulase từ các đơn chủng đã được tiến hành nghiên cứu A. oryzae có khả năng sản xuất cellulase (hoạt độ enzyme 6,01 FPU/gds) trong quá trình lên men ở trạng thái rắn bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (response surface methodology). Chế phẩm cellulase từ loài nấm mốc A. oryzaetrên mật rỉ cho hoạt độ cellulase cao nhất là 27,99 U/mL. Một số chủng thuộc Streptomyces sp. có khả năng sinh cellulase. Loài Streptomyces rocheicó khả năng sinh cellulase cao trên môi trường bán rắn. Tuy nhiên, việc kết hợp A. oryzae và  Streptomyces để sinh cellulase chưa được nghiên cứu đầy đủ  ở trong và ngoài nước.

Việc  sử  dụng chế phẩm sinh học trong xử lý tách nhớt hạt cà phê tại Việt Nam đã được quan tâm nhưng chưa phổ biến. Hiện nay, các chế phẩm sử dụng trong xử lý tách nhớt đa phần là ngoại nhập, giá thành tương đối cao, các chế phẩm enzyme trong nước chưa được sản xuất rộng rãi và thương mại hóa còn hạn chế. Vì vậy, với mục đích nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp cellulase, tăng khả năng thương mại hóa và ứng dụng trong thực tiễn, việc tiến hành nghiên cứu  sản xuất chế phẩm Aspergillus oryzae KZ3 kết hợp Streptomyces  rochei HĐM03 có khả năng sinh cellulase cao trên môi trường bán rắn (cám gạo - trấu) và ứng dụng trong xử lý tách nhớt hạt cà phê.

1. Nguyên vật liệu

Aspergillus oryzae  KZ3 và  S. rochei HĐM03  sử  dụng  trong  nghiên  cứu  được phân lập từ mẫu ngô và đất thu thập tại tỉnh Thừa Thiên Huế. Các chủng này được định danh bằng giải trình tự gene 28S rRNA của nấm và 16S rRNA của xạ khuẩn. So sánh trình tự gene thu được với ngân hàng gene bằng công cụ BLASTn trên National Center for  Biotechnology Information (NCBI) để định danh loài. Các chủng được nuôi cấy và lưu giữ tại phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Cơ khí và Công nghệ, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế. Chủng A. oryzae KZ3 sử dụng trong nghiên cứu này ở dạng sinh khối khô và  S. rochei HĐM03 sử dụng ở dạng sinh khối tươi.

Hạt cà phê sử dụng cho thử nghiệm là hạt cà phê vối (Coffea  robusta) đạt độ chín được thu hái thủ công bằng tay tại vườn cà phê của nông dân tỉnh Gia Lai.

Cám gạo và trấu được thu mua trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế.

2. Bố trí thí nghiệm

-  Khảo  sát  ở  quy  mô  phòng  thí nghiệm: Để xác định ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh cellulase ngoại bào của  A.  oryzae  KZ3  kết  hợp  với  S.  rochei HĐM03, chúng tôi tiến hành thực hiện thay đổi tuần tự từng yếu tố và cố định các yếu tố  còn  lại.  Để  thực  hiện  thí  nghiệm  này, chúng tôi đã khảo sát sơ bộ ban đầu việc sử dụng chủng A. oryzaeKZ3 riêng lẻ đến hoạt tính cellulase trên môi trường cám - trấu (tỷ lệ 7:3) với các tỷ lệ tiếp giống ở dạng sinh khối khô là 0,1; 0,2; 0,3 và 0,4% nhằm xác

định tỷ lệ giống nấm mốc bổ sung tốt nhất để thu được chế phẩm có hoạt tính cellulase cao.

Sau khi đã lựa chọn được tỷ lệ giống A. oryzae KZ3 thích hợp, chúng tôi khảo sát kết  hợp  A.  oryzae  KZ3  với  S.  rochei HĐM03, S. rochei HĐM03 được thay đổi ở các tỷ lệ tiếp giống ở dạng sinh khối tươi (2, 4, 6 và 8%), so sánh với các mẫu đối chứng gồm ĐC1 (chỉ sử dụng  S. rochei  HĐM03 với tỷ lệ 8%); ĐC2 (chỉ sử dụng  A. oryzae KZ3 với tỷ lệ 0,3%); các mức tỷ lệ thành phần môi trường (cám gạo - trấu) là 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 và 9:1; độ ẩm cơ chất được khảo sát ở 40, 45, 50, 55 và 60%; nhiệt độ nuôi cấy ở 25, 28, 30, 35 và 40oC. Sau khi xác định được  các  thông  số  thích  hợp  ở  trên,  khả năng sinh tổng hợp cellulase ngoại bào của chủng này được khảo sát theo thời gian nuôi cấy là 1, 2, 3, 4 và 5 ngày. Chế phẩm sau khi nuôi cấy được khảo sát chế độ sấy ở các mức nhiệt độ 40, 45, 50, 55oC để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến chất lượng chế phẩm.

- Khảo sát quy mô phòng thí nghiệm và quy mô pilot: Chế phẩm được sử dụng để xử lý tách nhớt hạt cà phê ở quy mô phòng thí nghiệm với tỷ lệ bổ sung 6% ở nhiệt độ phòng trong 10 giờ để đánh giá hiệu lực chế phẩm. Ứng dụng chế phẩm  A. oryzae  KZ3kết hợp S. rochei HĐM03 ở quy mô pilot tại Công ty Trách nhiệm Hữu hạn Thương mại & Dịch vụ Nông Nghiệp Xanh Thiên Hưng, địa chỉ  xã  Ia Kênh,  thành phố  Pleiku,  tỉnh Gia Lai để tách nhớt, sản xuất cà phê nhân. Khối lượng nguyên liệu 50 kg/mẻ, chế phẩm được bổ sung ở tỷ lệ 6%, lên men ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 giờ.

3. Phương pháp phân tích

3.1. Xác định mật độ tế bào và hoạt độ cellulase của chế phẩm A. oryzae KZ3 kết hợp S. rochei HĐM03

Chế phẩm  A. oryzae KZ3 kết hợp  S. rochei  HĐM03 sau khi nuôi cấy được xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn  lạc  trên  môi  trường  PDA  (Potato Dextrose  Agar)  và  Gause  I  (Trần  Linh Thước,  2006).  Hoạt  độ  cellulase  của  chế phẩm  A.  oryzae  KZ3  kết  hợp  S.  rochei HĐM03  được  xác  định  dựa  vào  sự  thủy phân  cơ  chất  carboxymethyl  cellulose (CMC)  bởi  carboxymethyl  cellulase.  Kết quả  của  phản  ứng  thủy  phân  tạo  ra  một lượng đường khử phản ứng với acid 3,5 - dinitrosalicylic  (DNS),  màu  sắc  sau  phản ứng  được  xác  định  bằng  cách  đo  mật  độ quang  ở  bước  sóng  540  nm  (Hankin  và Anagnostakis, 1975).

3.2. Thu nhận enzyme thô từ canh trường nuôi cấy

Enzyme thô được thu nhận từ canh trường nuôi cấy bằng cách hòa tan 5 g canh trường trong 50 ml nước cất vô trùng, sau đó, cho vào máy lắc trong 30 phút với tốc độ 130 vòng/phút. Sau khi lắc, canh trường được ly tâm ở 4⁰C trong 20 phút với tốc độ 5.000 vòng/phút. Phần dịch bên trên được lọc qua giấy lọc và dịch thu được chính là dịch  enzyme  thô.

3.3. Đánh giá hiệu lực của chế phẩm A. oryzae KZ3 kết hợp S. rochei HĐM03 trong xử lý tách nhớt hạt cà phê

Đánh giá hiệu lực của chế phẩm A. oryzae KZ3 kết hợp S. rochei HĐM03 trong xử lý tách nhớt hạt cà phê, cân 100 g hạt cà phê đã tách lớp vỏ cứng, bổ sung chế phẩm khô và tiến hành ủ trong 10 giờ ở nhiệt độ phòng trong điều kiện hiếu khí. Enzyme được sinh tổng  hợp bởi chế phẩm sẽ thủy phân lớp nhớt hạt cà phê. Sau đó, cà phê được rửa sạch và sấy ở 50⁰C trong 12 giờ. Đo độ ẩm và cân cà phê sau khi tách nhớt để tính hiệu suất tách nhớt. Hiệu suất tách nhớt thể hiện hiệu quả của chế phẩm.

3.4. Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả thí nghiệm được phân tích phương sai một nhân tố ANOVA (Anova single factor)  và so sánh các giá trị trung bình  bằng  thử  nghiệm  DUNCAN (Duncan’s Multiple Range Test) trên phần mềm thống kê SPSS (phiên bản 22) với mức ý nghĩa p<0.05.

4. Kết luận

Chế phẩm A. oryzaeKZ3 kết hợp  S. rocheiHĐM03 sinh tổng hợp cellulase cao nhất trên môi trường bán rắn với tỷ lệ cám gạo: trấu là 7:3; tỷ lệ nấm mốc A. oryzaeKZ3 và xạ khuẩn S. rochei HĐM03 nuôi cấy: 0,3% và 6%; độ ẩm cơ chất ban đầu 55%; nuôi  cấy ở  30⁰C  trong 4 ngày. Chế phẩm thu được có hoạt độ cellulase và mật độ tế bào đạt tương ứng là 971,038 UI/g và 8,463 logtb/g được sấy ở 40⁰C trong 6 giờ để giảm độ ẩm. Bổ sung chế phẩm A. oryzae KZ3 kết hợp S. rocheiHĐM03 với tỷ lệ 6% để xử lý tách nhớt cà phê nhân ở quy mô 50 kg  hạt  cà  phê  với  hiệu  suất  tách  nhớt  đạt được 98,83%.