Ảnh minh họa

Trên toàn thế giới, sản lượng rau quả tươi đã tăng 30% trong những năm qua. Tuy nhiên, trên rau quả hiện nay thường tồn tại những tác nhân gây bệnh do vi khuẩn và nấm ảnh hưởng đến chất lượng của rau quả, làm rau quả nhanh hư hỏng. Điển hình như các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra trên cam làm ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng của quả sau thu hoạch, sự thối rữa bệnh lý do nấm hoặc vi khuẩn gây ra làm quả yếu đi và ảnh hưởng đến khả năng chín của quả. Trên cà chua, vi khuẩn Erwinia sp. có thể xâm nhập vào cây qua các vết thương hoặc thông qua các khe hở tự nhiên trên bề mặt  thực vật do xây xước, côn trùng. Vi khuẩn khi xâm nhập vào vết thương của quả cà chua sẽ sinh trưởng và nhân lên, sản sinh ra các enzyme phá vỡ thành tế bào, làm mềm mô và chảy dịch, dịch này cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển. Vi khuẩn tiếp tục di chuyển, tiết ra enzyme và gây thối nhũn quả cà chua. Vi khuẩn Erwinia papayae gây bệnh thối nhũn trên quả đu đủ cũng đã được báo cáo từ nhiều nguồn trên thế giới với triệu chứng gồm các đốm đen trên quả, quả bị mềm nhũn dẫn đến thối quả. Những bệnh này do vi sinh vật gây ra làm ảnh hưởng đến nguồn cung rau quả và lương thực của thế giới.

Thuốc trừ sâu hóa học và thuốc kháng sinh đã được sử dụng từ lâu để phòng chống lại các bệnh do vi khuẩn ở thực vật. Tuy nhiên, việc sử dụng các hợp chất này gây  ra  một  số  vấn  đề  như  tăng  khả  năng kháng thuốc của mầm bệnh, đất nhiễm mặn và ô nhiễm môi trường. Do đó việc tìm kiếm các tác nhân kháng vi sinh vật mới để kiểm soát vi khuẩn và  nấm bệnh trên thực vật thay thế, thân thiện với môi trường và ít phụ thuộc vào hóa chất là một điều cần thiết. Hiện nay, sử dụng các chất hoạt tính sinh học từ vi sinh vật đang là một biện pháp đầy tiềm năng nhằm kiểm soát nhóm tác nhân nấm và vi khuẩn gây bệnh sau thu hoạch.

Xạ khuẩn được coi là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp do có khả năng sinh nhiều hoạt chất được sử dụng để kiểm soát vi khuẩn và vi nấm gây bệnh thực vật. Chúng có khả năng tiết các chất chuyển hóa thứ cấp ức chế sinh trưởng (kháng sinh, độc tố, chất hoạt động bề mặt, chất dễ bay hơi), có thể ngăn chặn  hoặc tiêu diệt vi sinh vật khác. Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomycesđược xem là nguồn sản xuất chất kháng sinh nhiều nhất. Mặc dù xạ khuẩn chi Streptomycesđược xem như là tác nhân có hoạt tính sinh học mạnh, có tiềm năng kháng nấm, kháng khuẩn trong lĩnh vực nông nghiệp nhưng việc  sử  dụng chúng như là một tác nhân kiểm soát một số bệnh hại do vi khuẩn gây ra trên rau quả vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ. Mục tiêu của nghiên cứu này là tìm kiếm các chủng Streptomycescó khả  năng  kháng  vi  khuẩn  gây  bệnh  như bệnh đốm đen trên cam, thối nhũn trên cà chua và đu đủ, đồng thời đánh giá độ bền nhiệt độ và độ bền pH của dịch nổi thu nhận từ các chủng Streptomyces được chọn ở điều kiện in vitro.

1. Nội dung

Vi khuẩn Pseudomonas syringae P01gây bệnh đốm đen trên cam, Pectobacterium carotovorum Ecc4 gây bệnh thối nhũn trên cà chua, Erwinia papayae M16 gây bệnh thối mềm trên đu đủ và 50 chủng Streptomyces được cung cấp bởi phòng Thí nghiệm vi sinh, khoa Cơ khí và Công nghệ, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế.

2. Phương pháp nghiên cứu

2.1. Sàng lọc sơ bộ khả năng kháng khuẩn của các chủng Streptomyces

Sàng lọc khả năng kháng khuẩn của các chủng Streptomyces sp. bằng cách sử dụng kỹ thuật cấy vệt vuông góc theo mô tả của Dezfully và Ramanayaka. Các chủng Streptomyces được cấy vệt ở tâm đĩa Petri (rộng khoảng 1,5 cm, dài bằng đường kính  đĩa) có chứa môi  trường ISP4 (International Streptomyces Project 4), các đĩa được ủ ở 28 – 30⁰C trong 4 - 5 ngày. Sau đó, vi khuẩn gây bệnh được cấy vạch vuông góc với vạch  Streptomyces. Ủ đĩa ở 30⁰C, sau 24 giờ, xác định khả năng kháng khuẩn của các chủng Streptomycesdựa trên việc quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên đĩa. Sàng lọc, tuyển chọn các chủng Streptomyces có  hoạt  tính  kháng  khuẩn mạnh dựa trên khoảng cách ức chế sự phát triển của vi khuẩn, tính từ vạch khuẩn lạc Streptomyces đến vị trí vi khuẩn có thể phát triển.  Chủng  Streptomyces có khả năng kháng mạnh khi chúng ức chế gần như hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn; kháng yếu khi chúng chỉ ức chế một phần sự phát triển của vi khuẩn, vi khuẩn vẫn có thể phát triển về phía vạch Streptomyces. Chủng Streptomyces  không có khả năng kháng là chủng mà vi khuẩn có khả năng phát triển đến rìa khuẩn lạc của Streptomyces.

2.2. Thu dịch nổi không chứa tế bào (Cell Free Supernatant_CFS)

Sau khi sàng lọc, tuyển chọn được chủng Streptomyces có khả năng kháng khuẩn mạnh  nhất, nuôi cấy chủng Streptomycesđã chọn trong bình tam giác 250 ml có 100 ml môi trường ISP4 trên máy lắc (180 vòng/ phút) ở nhiệt độ 28 ± 2°C trong 7 ngày. Ly tâm dịch nuôi cấy ở 4⁰C (10.000 vòng/phút) trong 15 phút, thu sinh khối và dịch nổi. Phần dịch nổi được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,22 µm để loại bỏ tế bào, thu dịch nổi không chứa tế bào (CFS)  để xác định khả  năng kháng khuẩn của chủng Streptomyces.

2.3. Xác định độ bền nhiệt và bền pH của CFS

Độ bền nhiệt độ và pH về khả năng kháng khuẩn của CFS cũng được xác định dựa  trên  phương  pháp  khuếch  tán  giếng thạch. Đối với thí nghiệm khảo sát độ bền nhiệt  độ,  CFS  được điều chỉnh về pH 7, nâng và giữ ở các khoảng nhiệt độ 30, 60, 90 và 121°C trong 15 phút trong nồi cách thủy, làm nguội. Đối với thí nghiệm khảo sát độ bền pH, sử dụng HCl  0,1 N và NaOH 0,1 N để hiệu chỉnh pH của CFS và kháng sinh Erythromycin đến pH 5, 6, 7, 8 và 9. Đối với mỗi thí nghiệm, bổ sung 100 µl CFS đã xử lý nhiệt vào các giếng thạch đã chuẩn bị sẵn để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng kháng khuẩn của CFS, lặp lại ba lần đối với mỗi nhiệt độ và pH khảo sát.

2.4. Xác định khả năng kháng khuẩn của CFS

Khả năng kháng khuẩn của CFS thu từ chủng Streptomyces đã chọn được xác định theo phương pháp khuếch tán giếng thạch. Trải đều 100 µl mỗi chủng vi khuẩn  P. syringae P01,  P. carotovorum Ecc4  và  E.  papayae  M16 (1×105CFU/ml) trên bề mặt các đĩa Petri có chứa 20 ml môi trường Mueller Hinton Agar, mỗi chủng vi khuẩn 3 đĩa. Trên mỗi đĩa, đục 3 giếng thạch có đường kính 7 mm.

Trong đó, giếng thứ nhất chứa 100 µl nước cất đã tiệt trùng làm đối chứng âm, giếng thứ hai chứa 100 µl dung dịch kháng sinh Erythromycin (30 µg/ml) làm đối chứng dương và giếng thứ ba chứa 100 µl CFS đã xử lý theo các thí nghiệm khảo sát để đánh giá  khả năng  kháng  khuẩn  của  chúng. Các đĩa được giữ ở nhiệt độ 4⁰C trong 4 giờ, sau đó ủ ở 37⁰C trong 24 giờ. Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá dựa trên đường kính vòng kháng khuẩn, được xác định theo công thức: ĐK = (D – d) (mm). Trong đó: ĐK là đường kính vòng ức chế vi khuẩn (mm), D là đường kính vòng kháng khuẩn (bao gồm đường kính lỗ thạch)  (mm), d là đường  kính  lỗ thạch (mm).

2.5. Phương pháp xử lý số liệu

Các giá trị trung bình các kết quả thí nghiệm được xử lý sử dụng phần mềm IBM SPSS  Statistics 25 chạy  trên  môi  trường Windows. Kết quả thí nghiệm được phân tích phương  sai một nhân tố ANOVA,  so sánh các giá trị trung bình bằng kiểm định Duncan và phương  pháp so sánh cặp (paired-samples T-test) (với mức ý nghĩa p = 0,05).

3. Kết luận

Trong số 50 chủng xạ khuẩn Streptomycesđược đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, S. murinusNARZ là chủng có khả năng kháng mạnh đối  với cả 3 chủng vi khuẩn P.  syringae  P01, P.  carotovorumEcc4 và  E. papayaeM16.  Chủng S. murinusNARZ thể hiện khả năng kháng khuẩn ở cả nhiệt độ 121⁰C, tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn thể hiện tốt nhất ở 30⁰C. Hoạt tính kháng khuẩn duy trì ở pH từ 5 - 9 trong đó tốt nhất ở pH = 5 đối với P. syringae P01 và pH = 6 đối với P. carotovorumEcc4 và E. papayae M16. Kết quả này có tiềm năng trong việc nghiên cứu ứng dụng chủng S. murinus NARZ trong kiểm soát vi khuẩn gây bệnh đốm đen trên cam, bệnh thối mềm trên cà chua và đu đủ sau thu hoạch trên rau quả.