Trong những năm gần đây, dịch bệnh trên cá rô phi do vi khuẩn Streptococus agalactiae ngày càng tăng và trở thành một thách thức lớn cho nghề nuôi cá nước ngọt nói chung và cá rô phi nói riêng. Biểu hiện của bệnh do vi khuẩn S. agalactiae gây ra là mắt bị lồi đục, có hiện tượng bơi xoắn ốc hoặc bơi vòng tròn, xuất huyết và viêm màng não, và có tỉ lệ gây chết cao lên đến 60 -70% trong vòng 5 - 7 ngày, do đó gây nên nhiều thiệt hại kinh tế cho người nuôi. Cho đến nay, khả năng gây nhiễm tự nhiên của vi khuẩn này chỉ giới hạn ở bốn phân nhóm (clonal complexes - CC) đã biết, mỗi phức hợp lại liên kết với một kiểu huyết thanh khác nhau: CC7 với kiểu huyết thanh Ia, CC283 với kiểu huyết thanh III, CC552 với kiểu huyết thanh Ib và CC2 với kiểu huyết thanh IV. Tuy nhiên gây bệnh cho cá rô phi nuôi tại Việt Nam hiện nay chủ yếu là các chủng thuộc hai phức hợp CC283 (kiểu huyết thanh III) gây bệnh trên cá nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long và CC552 (kiểu huyết thành Ib) gây bệnh trên cá nuôi ở Thừa Thiên Huế. Sử dụng kháng sinh là giải pháp phổ biến được nhiều hộ nuôi lựa chọn để phòng trị bệnh do vi khuẩn S. agalactiae trên cá rô phi. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh có thể gây nên hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản.

Điều này dẫn đến việc giảm hiệu quả sử dụng thuốc, đồng thời gây nên các vấn đề về sức khỏe cho con người và ô nhiễm môi trường do tồn dư lượng lớn thuốc kháng sinh cả trong cơ thể động vật thủy sản và ngoài môi trường nuôi. Thảo dược được xem là giải pháp thay thế an toàn cho việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản. Rất nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước cũng cho thấy có một số loại thảo dược có hiệu quả tốt trong việc ức chế vi khuẩn gây bệnh trên cá. Các loại dược có khả năng kích thích tăng trưởng, kích  thích  miễn  dịch, hoạt  động kháng khuẩn và chống lại các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng. Sử dụng thảo dược thay thế cho thuốc kháng sinh trong quản lý sức khỏe cá không chỉ an toàn cho người tiêu dùng mà chúng còn có vai trò quan trọng trong nuôi trồng thủy sản.

Hiện nay, đã có một số nghiên cứu cho thấy rằng nhiều loại thảo dược có khả năng kháng  vi khuẩn Gram dương gây bệnh như tía tô, xuyên tâm liên, kinh giới, cỏ mực và một  số  loại thảo dược khác. Một số loại thảo dược đã được thử nghiệm trong phòng và trị bệnh cho các đối tượng thủy sản như: cây xoan (Melia azedarach L), sài đất (Wedelia chinensis),  tỏi (Allium sativum L.), cây xuyên tâm liên (Andrographus panicullata), cỏ nhọ nồi  (Eclipta  alba Hassk), cây trâm bầu (Combretum quadrangulare). Trong nghiên cứu này,  8  loại  cao chiết  thảo  dược  gồm:  tía  tô  (Perilla frutescens),  kinh  giới  (Elsholtzia  ciliata), bạch  chỉ  (Angelica  dahurica), xuyên tâm liên (Andrographis paniculata),  cỏ  mực (Eclipta  prostrata), cỏ gà (Cynodon dactylon), sài đất (Wedelia chinensis), mướp đắng (Momordica  charantia) được sử dụng để đánh giá khả năng kháng Streptococus agalactiae trong điều kiện in vitro  và  thử  độc  tính  trên cá  rô  phi  nhằm chọn ra loại thảo dược có hiệu quả cao để làm tiền đề cho việc tạo chế phẩm thảo dược phòng trị bệnh trên cá rô phi.

1. Nguồn gốc thảo dược và phương pháp chiết xuất cao chiết

1.1. Nguồn gốc thảo dược

Các loại thảo dược tía tô (Perilla frutescens), kinh giới (Elsholtzia ciliata), bạch chỉ (Angelica  dahurica),  xuyên  tâm liên  (Andrographis  paniculata),  cỏ  mực (Eclipta  prostrata), cỏ gà (Cynodon dactylon), sài đất (Wedelia chinensis), mướp đắng  (Momordica  charantia) được thu gom nguyên cây ở Thừa Thiên Huế, được đem về phòng thí nghiệm, sau đó đưa đi rửa sạch với nước và thu lá cắt nhỏ; riêng bạch chỉ thu phần rễ củ. Các loại thảo dược được cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 60-70⁰C trong 6 giờ trước khi chiết xuất cao chiết.

Nghiền nhỏ riêng từng loại thảo dược khô bằng máy xay sinh tố đa năng Philips HR2221/00 (Hà Lan). Bảo quản thảo dược ở  4⁰C. 

1.2. Phương pháp chiết xuất

Cao chiết các loại thảo dược trong các dung môi: methanol 99,8%, cồn 96% và nước cất gồm các bước như sau: Cân mỗi loại thảo dược 30 g và chia thành 3 phần bằng nhau, trộn lần lượt với 3 loại dung môi gồm nước cất, ethanol và methanol với tỷ lệ 1: 10 (tương  đương 10 g thảo dược và 100 mL dung môi). Sau đó đem  chưng cách thủy ở nhiệt độ 60-70⁰C trong vòng 120 phút, lọc để loại bỏ phần bã thảo dược. Dịch chiết của 3 loại dung môi đem đi cô quay ở nhiệt độ 60⁰C, áp suất chân không để loại bỏ hết dung môi, sau đó cho nước cất đủ 20 mL (bằng 1/5 thể tích ban đầu) thu được cao chiết thí nghiệm, và bảo quản ở nhiệt độ -20ºC để sử dụng trong các thí nghiệm.

2. Vi khuẩn thí nghiệm

12 chủng vi khuẩn gây bệnh Streptococcus agalactiae  được phân lập từ mẫu  cá  rô  phi  bị  bệnh  lồi  mắt  xuất  huyết trong đó 6 chủng thuộc Sequence Type (ST) 283 (kiểu huyết thanh III) phân lập tại Cần Thơ và 6 chủng ST 1395 (kiểu huyết thanh Ib) phân lập tại Thừa Thiên Huế. Các chủng vi khuẩn đã được định danh là S. agalatia group B thuộc phân nhóm Clonal complex (CC) 283 kiểu huyết thanh III và kiểu huyết thanh Ib thuộc CC 552 bằng phương pháp MLST (Multilocus Sequence  Typing)  tại  trường  Đại  học Glasgow, Vương quốc Anh và được cung cấp  từ  phòng  thí  nghiệm  Khoa  Thủy  sản, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế.

Các chủng vi khuẩn đã được định danh là  S. agalactiae  được bảo quản trong glycerol 15% và được bảo quản ở nhiệt độ -4⁰C. Mẫu vi khuẩn được đem nuôi cấy và phục hồi bằng phương pháp cấy ria trên đĩa môi trường Tryptic Soy agar (TSA, Himedia,  Ấn  Độ). Dùng que cấy vòng  đã thao tác vô trùng nhúng vào dung dịch mẫu có chứa chủng vi khuẩn S. agalactiae bảo quản trong glycerol 15%. Ria que cấy thành các đường trên đĩa petri có chứa môi trường TSA. Sau mỗi đường ria, đốt khử trừng que cấy  và  làm  nguội  trước  khi  thực  hiện  các đường ria tiếp theo. Dùng parafin bao bọc kín và nuôi cấy ở nhiệt độ 28°C trong 24 giờ. S. agalactiae  tạo khuẩn lạc nhỏ, màu trắng, tròn trên môi trường  TSA.  Sau  đó, chủng vi khuẩn thí nghiệm được nuôi cấy tăng  sinh  trong  môi  trường  Tryptic  Soy Broth (TSB, Himedia, Ấn Độ) trong tủ ấm (GFL 3032, hãng GFL) ở 30°C với tốc độ lắc 180 vòng/phút trong 24 giờ. Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy được xác định theo phương pháp đo mật độ quang học (Optical density- OD) ở bước sóng 600 nm trên máy quang phổ  UV-VIS (U2900, Hitachi, Nhật Bản) và được pha loãng về giá trị OD=1 (tương đương mật độ vi khuẩn là 108 cfu/mL). Mật độ vi khuẩn sau đó được pha loãng về 106 cfu/mL để thử khả năng kháng khuẩn của cao chiết thảo dược ở các loại dung môi khác nhau.

3. Cá thí nghiệm

Cá rô phi (Oreochromis sp.), trọng lượng cơ thể trung bình 20 g được mua từ Trung tâm giống Thuỷ sản Thừa Thiên Huế và được nuôi ở trong bể composite 1 m³ tại phòng thí nghiệm Bệnh học thuỷ sản, Khoa Thuỷ sản, trường Đại học Nông Lâm Huế. Cá được nuôi cách ly trong bể nhựa 1000-L với nhiệt độ duy trì trong khoảng 28-30⁰C trong 14 ngày Cá thí nghiệm được cho ăn bằng thức ăn Cargill (Việt Nam) hai lần/ngày ở mức 3% trọng  lượng thân vào lúc 8 giờ sáng và 2 giờ chiều. Sục khí liên tục 24 giờ/ngày. Trước khi bố trí thí nghiệm, đàn cá được kiểm tra không bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus  agalactiaebằng cách cấy trực tiếp mẫu não của 5 cá ngẫu nhiên trong bể lên môi trường TSA và ủ ở nhiệt độ 28⁰C trong 24 giờ.

4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết

Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ các loại thảo dược ở các dung môi  khác nhau gồm các bước như sau: Trải đều vi khuẩn lên môi trường Muller  Hinton  agar  (MHA,  Himedia,  Ấn Độ) đã chuẩn bị trước. Đĩa thạch được để  khô 15 phút trước khi đục các lỗ giếng đường kính 6 mm với khoảng cách thích hợp trên đĩa thạch đã trải vi khuẩn. Hút chính xác 100  μL nước cất vào các giếng thạch để làm đối chứng âm. Sau đó cho 100 μL cao chiết của  các loại thảo dược trong các dung môi methanol, ethanol và nước cất (nồng độ tương  đương 2500 μg/giếng) vào các giếng khác nhau. Đối chứng dương với kháng sinh là  penniciline (125 μg).

Sau đó  để  30 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch trước khi ủ ở nhiệt độ 28 -  30⁰C. Kiểm tra đường kính vòng kháng khuẩn sau  24 giờ. Mức  độ kháng vi sinh vật của cao chiết thảo dược được thí nghiệm được tiến hành 4 lần lặp lại. Từ kết quả sàng lọc khả năng kháng khuẩn, 4 loại cao chiết thảo dược trong dung môi thích hợp cho kết quả tốt nhất được chọn để xác định nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ tiêu diệt tối thiểu (MBC) cũng như thử khả năng kháng khuẩn và độc tính trên cá rô phi.

5. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration -MIC) và nồng  độ tiêu diệt tối thiểu (Minimum Bactericidal Concentration – MBC) của cao chiết từ các loại thảo dược

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định theo phương pháp pha loãng nồng độ trên đĩa 96 giếng theo phương pháp của CLSI (2012).

Chuẩn bị vi khuẩn: Mười hai chủng vi khuẩn S. agalactiae  thuộc hai phân nhóm ST 283 (kiểu huyết thanh III) và ST1395 (kiểu huyết thanh Ib) được chuẩn bị, sau đó mật độ vi  khuẩn sau đó được pha loãng về 106 cfu/mL để thử nghiệm.

Cao chiết thảo dược: Bốn loại cao chiết thảo dược trong loại dung môi cho kết quả kháng khuẩn tốt nhất được lựa chọn để tiến hành thí nghiệm.

Cho 100 µL dung dịch vi khuẩn vào từng giếng của đĩa 96 giếng chứa sẵn 100µL dung dịch cao chiết các loại thảo dược được pha loãng thành các nồng độ khác nhau theo cơ số 2 với dung dịch gốc ban đầu là nồng độ 5000 mg/L cho đến 15,5 mg/L. Sau đó bổ sung 20 µL thuốc thử resazurin 0,01% vào mỗi giếng và được nuôi cấy ở 30°C trong 24 giờ. Thuốc thử resazurin có màu xanh dương trong dung dịch, các giếng có sự tăng trưởng của vi khuẩn sẽ làm đổi màu của dung dịch resazurin từ màu xanh sang màu hồng. Quan sát sự đổi màu, ghi nhận giá trị MIC là nồng độ của giếng không làm đổi màu của thuốc thử resazurin ở nồng độ thấp nhất của dịch chiết ức chế được mật độ vi khuẩn.

Nồng độ tiêu diệt tối thiểu (MBC) được xác định theo CLSI (1998) bằng phương pháp trải đĩa thạch. Hút chính xác 20 µL dịch thử nghiệm trên các giếng không có  sự  đổi  màu  của resazurin  0,01%  từ thí nghiệm  trên,  nhỏ  lên  môi  trường  thạch MHA đã chuẩn bị sẵn và được ủ ở 30⁰C sau 24 giờ để quan sát sự sống sót của vi khuẩn.

Giá trị MBC là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ của cao chiết có thể tiêu diệt toàn bộ  vi khuẩn trong giếng (vi khuẩn không phát triển trên đĩa thạch).

6. Khảo sát độc tính của các cao loại thảo dược trên cá rô phi

Chuẩn bị thảo dược: 4 loại cao chiết có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất được khảo sát độc tính trên cá rô phi bằng phương pháp cho ăn. Độc tính của các cao chiết này trên cá rô phi được khảo sát ở các nồng độ: 1x MBC, 5x MBC và 10x MBC (pha loãng bằng dung môi  Phosphate-buffered saline (PBS) và được ủ ở 28⁰C trong 3 giờ. Trộn thức ăn cùng dung dịch thảo dược để cho cá thí nghiệm  ăn. Nghiệm thức đối chứng âm là trộn PBS vào thức ăn. Cá được thả  nuôi riêng trong bể thể tích 120-L với hệ thống nước chảy tốc độ 14 L/ phút, nhiệt độ duy trì trong khoảng 28-30⁰C và được cho ăn 2 lần mỗi ngày với liều lượng 3% trọng lượng thân  vào lúc 8 giờ sáng và 2 giờ chiều. Thức ăn sử dụng trong thí nghiệm là Cargill (Việt Nam). Mỗi nghiệm thức gồm 10 con cá và được lặp lại 3 lần. Tổng số cá trong thí nghiệm này 360 con. Thử nghiệm được thực hiện trong 14 ngày, tỷ lệ chết của cá được theo dõi và ghi nhận hàng ngày.

7. Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn của cao thảo dược trên cá rô phi

Bốn  loại  cao  chiết  trong  loại  dung môi có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất được đánh giá khả năng kháng khuẩn trên cá rô phi  bằng  phương pháp tiêm Balasubramnian  và  cs.,.  Chủng vi khuẩn S. agalactiae ST 283 (kiểu  huyết thanh III) được sử dụng trong thí nghiệm này.

Thí nghiệm được bố trí trên  180 cá gồm 6  nghiệm thức bao gồm: nghiệm thức đối chứng âm –  cá được tiêm với PBS, đối chứng dương – cá được tiêm với huyền phù vi khuẩn với mật độ 106 cfu/mL (liều gây chết 50% LD50 được xác định từ nghiên cứu, bốn nghiệm thức còn lại –  cá được tiêm với hỗn  hợp dung dịch vi khuẩn mật độ 106 cfu/mL trộn với cao thảo dược ở nồng độ MBC được xác định ở thí nghiệm và ủ ở 28⁰C trong 3 giờ.  Thể  tích  dung  dịch  tiêm  vào  xoang bụng  của  mỗi  cá  là  0,1  mL,  mỗi  nghiệm thức gồm 10 con cá và được lặp lại 3 lần. Cá sau khi cảm nhiễm được nuôi trong bể nhựa 120-L với hệ thống nước chảy tốc độ 14 L/ phút, nhiệt độ duy trì trong khoảng 28-30⁰C. Cá thí nghiệm được cho ăn bằng thức ăn Cargill (Việt Nam) hai lần/ngày ở mức duy trì (2% trọng lượng thân) vào lúc 8 giờ sáng và 2 giờ chiều. Sục khí liên tục 24 giờ/ngày. Tỷ lệ chết của cá được ghi nhận hàng ngày. Phân lập vi khuẩn từ não và thận đối với cá chết trong suốt thí nghiệm.  Kết thúc thí nghiệm, phân lập vi khuẩn từ não với 50% cá sống ở mỗi nghiệm thức. Căn cứ vào tỷ lệ sống của cá tại các nồng độ thảo dược khác nhau để đánh giá hoạt tính bảo vệ cá trước vi khuẩn S. agalactiae của các loại cao chiết từ thảo dược.

8. Phương pháp xử lý số liệu

Tất cả các số liệu thí nghiệm được xử lý thống  kê  theo  phân  tích  phương sai (ANOVA)  bởi trình ứng  dụng GLM (General Linear Model) của phần mềm SPSS 20.0. Sự sai khác giữa các giá trị trung bình được xác định theo phương pháp Tukey với độ tin cậy 95%.

9. Kết luận

Trong 8 loại thảo dược được sử dụng để  thí  nghiệm,  cao  chiết  tía  tô,  kinh  giới, xuyên tâm liên, cỏ mực với dung môi nước và methanol có khả năng kháng khuẩn tốt nhất đối với các chủng  S. agalactiae  ở cả hai nhóm huyết thanh III và Ib.

Giá trị MIC và MBC của các loại cao chiết thảo dược không phụ thuộc vào kiểu huyết thanh của vi khuẩn thí nghiệm. Xuyên tâm liên cho khả năng kháng khuẩn tốt nhất.

Các loại cao chiết xuyên tâm liên, kinh giới, tía tô, và cỏ mực trong dung môi nước được xác định an toàn cho cá rô phi và có thể sử dụng trong nghiên cứu phòng trị bệnh trên cá.

Cả 4 loại cao chiết thảo dược xuyên tâm liên, kinh giới, tía tô, và cỏ mực trong dung môi nước đều có khả năng bảo vệ cao cho cá rô phi với vi khuẩn S. agalactiae.