Việt Nam cũng như các nước trên toàn thế giới khi mà số người mắc phải ngày càng tăng. Trong phác đồ điều trị bệnh tim mạch, việc phối hợp thuốc với liều cố định đang được chú trọng đầu tư nghiên cứu và chấp nhận rộng rãi. Trong đó có sự kết hợp giữa amlodipin besilat và indapamid để điều trị tăng huyết áp, sự kết hợp giữa hai thuốc này trong cùng một dạng bào chế mang lại nhiều ưu điểm như dễ tuân thủ trong điều trị, cho sinh khả dụng cao, hạn chế tác dụng không mong muốn của từng loại. Nghiên cứu định lượng được đồng thời amlodipin besilat và indapamid cần được thực hiện để làm cơ sở đánh giá hàm lượng hoạt chất trong viên thị trường, khả năng giải phóng hoạt chất trong dạng chế phẩm sau từng khoảng thời gian nhất định. Hiện nay, trong DĐVN 5 và USP 44 chỉ có chuyên luận định lượng đơn thành phần amlodipin và indapamid chưa có chuyên luận định lượng đồng thời hai chất này.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu:

Chất chuẩn: Amlodipin besilat số lô QT145 120122 (hàm lượng 103 % tính trên nguyên trạng), indapamid số lô QT264 020121 (hàm lượng 97,7 % tính trên nguyên trạng) do Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. Thuốc đối chứng Natrixam® (Công ty Les Laboratoires Servier Industrie-Pháp) số lô 6052969, còn hạn sử dụng 16 tháng, được mua tại nhà thuốc ở Cần Thơ có hóa đơn chứng minh nguồn gốc xuất xứ.

Dung môi và hóa chất: Acetonitril (ACN) và methanol (MeOH) đạt tiêu chuẩn sắc ký lỏng. Triethylamin (TEA), acid phosphoric và các dung môi dùng trong phân tích đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định.

Nghiên cứu được tiến hành tại Bộ môn Bào chế-Công nghiệp dược, Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ từ tháng 3/2023.

Phương pháp nghiên cứu:

Chuẩn bị mẫu

 Dung dịch chuẩn gốc amlodipin besilat: dung dịch có nồng độ khoảng 200 µg/mL trong methanol

Dung dịch chuẩn gốc indapamid: dung dịch có nồng độ khoảng 100 µg/mL trong methanol.

Dung dịch hổn hợp chuẩn amlodipin và indapamid: sử dụng dung môi pha động pha loãng để thu được dung dịch có nồng độ khoảng 10 µg/mL amlodipin và 1,5 µg/mL indapamid; lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch mẫu thử: Cân 20 viên thuốc Natrixam® SR 10 mg/ 1,5 mg, xác định khối lượng trung bình của 01 viên, nghiền bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khối lượng trung bình 01 viên, cho vào bình định mức 50 mL; thêm lượng tối thiểu MeOH, lắc kỹ cho tan và siêu âm 30 phút; thêm pha động vừa đủ 50 mL, lắc đều, lọc qua giấy lọc, bỏ khoảng 10 mL dịch lọc đầu. Hút chính xác 500 µL dịch lọc, cho vào bình định mức 10 mL, thêm pha động vừa đủ 10 mL, lắc đều, thu được dung dịch có nồng độ khoảng 10 µg/mL amlodipin và 1,5 µg/mL indapamid; lọc qua màng lọc 0,45 µm. độ khoảng 10 µg/mL amlodipin và 1,5 µg/mL indapamid; lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch mẫu trắng: Dung môi pha mẫu MeOH, pha động. Dung dịch giả dược (placebo): Cân chính xác khoảng hỗn hợp bột giả dược tương ứng 01 viên (thành phần nguyên liệu giả dược dựa theo patent của viên Natrixam® SR 10 mg/ 1,5 mg đã được công bố) [7], cho vào bình định mức 50 mL; thêm lượng tối thiểu MeOH, lắc kỹ cho tan và siêu âm 30 phút; thêm pha động vừa đủ 50 mL, lắc đều, lọc qua giấy lọc, bỏ khoảng 10 mL dịch lọc đầu. Hút chính xác 500 µL dịch lọc, cho vào bình định mức 10 mL; thêm pha động vừa đủ 10 mL, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Dung dịch mẫu trắng: Dung môi pha mẫu MeOH, pha động.

Dung dịch mẫu trắng: Dung môi pha mẫu MeOH, pha động. Dung dịch giả dược (placebo): Cân chính xác khoảng hỗn hợp bột giả dược tương ứng 01 viên (thành phần nguyên liệu giả dược dựa theo patent của viên Natrixam® SR 10 mg/ 1,5 mg đã được công bố) [7], cho vào bình định mức 50 mL; thêm lượng tối thiểu MeOH, lắc kỹ cho tan và siêu âm 30 phút; thêm pha động vừa đủ 50 mL, lắc đều, lọc qua giấy lọc, bỏ khoảng 10 mL dịch lọc đầu. Hút chính xác 500 µL dịch lọc, cho vào bình định mức 10 mL; thêm pha động vừa đủ 10 mL, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch giả dược (placebo): Cân chính xác khoảng hỗn hợp bột giả dược tương ứng 01 viên (thành phần nguyên liệu giả dược dựa theo patent của viên Natrixam® SR 10 mg/ 1,5 mg đã được công bố) [7], cho vào bình định mức 50 mL; thêm lượng tối thiểu MeOH, lắc kỹ cho tan và siêu âm 30 phút; thêm pha động vừa đủ 50 mL, lắc đều, lọc qua giấy lọc, bỏ khoảng 10 mL dịch lọc đầu. Hút chính xác 500 µL dịch lọc, cho vào bình định mức 10 mL; thêm pha động vừa đủ 10 mL, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Khảo sát điều kiện sắc ký

Sau khi tham khảo một số tài liệu nghiên cứu liên quan lựa chọn điều kiện sắc ký ban đầu như sau: Pha tĩnh: Cột sắc ký Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm); Chương trình rửa giải đẳng dòng ; Thể tích tiêm mẫu: 50 µL; Tốc độ dòng: 1 mL/phút; Bước sóng: 242 nm.

   Tiến hành khảo sát pha động theo trình tự: khảo sát loại pha động, khảo sát tỉ lệ pha động, khảo sát pH pha động. Dung môi sử dụng trong hệ pha động sẽ bao gồm những dung môi rửa giải tính phân cực từ trung bình đến cao như: ACN, MeOH, nước cất/hệ đệm phostphat - TEA 0,8%.

Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời amlodipin besilat và indapamid

Tính tương thích hệ thống; Tính đặc hiệu; Tính tuyến tính; Độ chính xác, Độ đúng: thực hiện theo hướng dẫn và quy định ICH.

Độ chính xác: Thể hiện ở độ lặp lại kết quả và độ chính xác trung gian thể hiện độ lặp lại kết quả qua các ngày khác nhau hoặc kiểm nghiệm viên khác nhau.

Độ đúng: Được thực hiện bằng cách thêm chuẩn vào mẫu giả dược ở ba mức nồng độ 80%, 100% và 120% so với nồng độ đo của từng hoạt chất. Tính tỉ lệ thu hồi dựa trên lượng chuẩn thêm vào và lượng tìm được.

Phương pháp HPLC với đầu dò PAD, cột Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 pha đảo, pha động gồm Acetonitril:Methanol:đệm triethylamin 0,8% pH 3,0 điều chỉnh bằng acid phosphoric (tỉ lệ 25:30:45, tt/tt), tốc độ dòng 1 mL/phút, bước sóng phát hiện 242 nm. Khoảng nồng độ tuyến tính amlodipin là 4-20 µg/mL, phương trình hồi qui của amlodipin là ŷ = 106,45x với R 2 = 0,9996 và khoảng nồng độ tuyến tính là 0,6-3 µg/mL indapamid là ŷ = 137,27x với R2 = 0,999. RSD của độ chính xác trong ngày amlodipin besilat và indapamid lần lượt là 1,63% và 1,56% và độ chính xác liên ngày lần lượt là 1,86% và 1,395%; độ đúng được thẩm định của amodipin besilat và indapamid với RSD lần lượt là 1,41% và 1,38% và độ thu hồi trong khoảng 98-102%.

Kết quả khảo sát thành công sự tách amlodipin besilat và indapamid, đồng thời xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời amlodipin besilat và indapamid từ điều kiện sắc ký khảo sát trên chế phẩm chứa amlodipin besilat 10 mg và indapamid 1,5 mg bằng phương pháp HPLC cho thấy quy trình đạt tính tương thích với hệ thống sắc ký, đảm bảo tính chọn lọc đặc hiệu, có độ đúng trong khoảng 98-102%, độ chính xác cao (RSD ≤ 2%) và đạt độ chính xác trung gian theo hướng dẫn quy định ICH.