Ứng dụng công nghệ sinh học để nhân giống và nhân nuôi sinh khối cây dược liệu là hướng nghiên cứu có thể mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn và có tính thương mại cao. Nhân giống vô tính in vitro có nhiều ưu điểm như hệ số nhân giống cao, cây giống giữ nguyên được các đặc tính của cây mẹ, đồng đều, sạch bệnh, sức sống cao khi đưa ra môi trường tự nhiên… nên đã và đang được ứng dụng rộng rãi vào sản xuất nhiều loại cây trồng, trong đó có cây dược liệu. Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu quy trình nhân giống  in vitro  cây  thành ngạnh. Kết quả đã tạo được cây in vitro sạch bệnh và bước đầu đã xác định được môi trường nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng cây thành ngạnh in vitro [3].

Hiện nay việc sản xuất các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc từ thực vật được chú trọng vì chúng an toàn đối với sức khoẻ con người. Tuy nhiên nguồn dược liệu trong tự nhiên đang bịsuy giảm nhanh chóng cả về lượng và chất do tình trạng khai thác quá mức như hiện nay, đi kèm với các tác động do biến đổi khí hậu gây ra như thời tiết ngày càng khắc nghiệt, lũ quét sạt lở xảy ra với mức độ thường xuyên hơn. Điều này dẫn đến nhiều loài dược liệu quý bị đe doạ nghiêm trọng, một số loài có nguy cơ tuyệt chủng làm ảnh hưởng lớn đến nguồn cung cấp dược liệu cho con người. Sản xuất sinh khối thông qua nuôi cấy rễ tơ chuyển gen đang là một hướng đi mới nhằm có thể  đáp ứng nhu cầu về  sản xuất hợp chất thứ cấp từ  thực vật nói chung và cây thành ngạnh nói riêng [3].

Nuôi cấy sinh khối rễ tơ nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes (A. rhizogenes) là một giải pháp hữu hiệu, có thể khắc phục được những hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống (dễ nhiễm dịch bệnh, tồn dư thuốc bảo vệ thực vật …) và phương pháp nuôi cấy tạo sinh khối tếbào thực vật (do tồn dư của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật trong tế  bào trong quá trình nuôi cấy gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người sử dụng). Tusevski và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu về rễ tơ của Hypericum perforatum L. (Hypericaceae) cho thấy rễ  tơ có khả  năng sản xuất các flavonol glycosides quercetin 6-C-glycoside, rutin và isorhamnetin O-hexoside; phân tích thành phần hợp chất trong rễ  tơ bằng HPLC đã xác định được sự  có mặt của kaempferol thuộc nhóm flavonoid aglycones; đồng thời kết quả  nghiên cứu cho thấy hàm lượng catechin và epicatechin trong rễ  chuyển gen cao hơn so với rễ  không chuyển gen  [4]. Từ  đó nuôi cấy rễ  tơ cây dược liệu là một phương pháp hữu ích cho việc sản xuất các hơp chất có hoạt tính sinh học cao. Ở Việt Nam, tạo dòng rễ tơ từ thực vật và đặc biệt ở cây thành ngạnh còn rất mới mẻ. Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định một số  yếu tố  ảnh hưởng đến hiệu quả  chuyển gen tạo rễ  tơ cây thành ngạnh (C. pruniflorum) thông qua vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834, trên cơ sở đó chọn lọc được dòng rễ  tơ có khả  năng sinh trưởng tốt, làm cơ sở cho những nghiên cứu sâu hơn sau này.

1. Nguyên vật liệu

Cây thành ngạnh in vitro từ phòng Thực nghiệm cây trồng - Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM, kế thừa từ nghiên cứu của Nguyễn Trần Phước Huy và cộng sự về nhân giống in vitro cây thành ngạnh (C. pruniflorum) [3]. Về chủng vi sinh vật, dòng vi khuẩn  A. rhizogeneATCC 15834 chứa plasmid pRi (Ri: root inducing) mang gen rol A, B và C,  được mua từ ngân hàng chủng vi sinh vật của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ  Chí  Minh. Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu gồm môi  trường SH, môi trường WPM, môi trường Yeast Mannitol Broth - YMB, Benzyl amino purine - BAP.

2. Phương pháp nghiên cứu

2.1. Khảo sát vật liệu thích hợp cho hình thành rễ tơ

Các mẫu lá, cuống lá và đoạn thân cây thành ngạnh in vitro được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu. Mẫu lá  in vitro  được cắt bỏ  mép lá và giữ  nguyên vẹn đường gân chính, mẫu cuống lá được cắt thành những đoạn 1 cm không chứa phần lá, mẫu đoạn thân được cắt thành đoạn 1,5 cm chứa nách lá. Các mẫu sau khi cắt được  lây nhiễm với vi khuẩn A.  rhizogenesATCC 15834 theo quy trình của Bulgakov và cộng sự  [5]. Sau khi lây nhiễm, các mẫu được đồng nuôi cấy trên môi trường SH thạch rắn trong điều kiện tối, nhiệt độ nuôi cấy 25 ± 2°C theo nhiệt độ quy định của phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật. Theo dõi tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ (%) sau 6 tuần nuôi cấy.

2.2. Khảo sát mật độ vi khuẩn và thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ  in vitro

Vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834 được lấy từ tủ âm sâu (-80⁰C) và hoạt hoá trên môi trường Yeast Mannitol Broth (YMB) thạch rắn. Theo quy trình chuyển gen tạo rễ tơ trên cây sâm Ngọc Linh của Hà Thị Loan và cộng sự, khuẩn lạc đơn được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường YMB lỏng lắc ở 25-26⁰C, 120-150 rpm, nuôi cấy tăng sinh trong 16-20 giờ [6]. Mật độ vi khuẩn đạt 104-  105CFU/mL được sử  dụng cho lây nhiễm. Trong nghiên cứu này, dung dịch vi khuẩn đã nuôi  ở  trên sau khi đạt được dung dịch vi khuẩn ở một số nồng độ tế bào khác nhau từ 3.102-6,3.106CFU/mL được đưa vào bình tam giác, ủ với mẫu trong thời gian từ 45 phút, lắc nhẹ trong bóng tối sau đó vớt ra thấm bằng giấy lọc vô trùng, đặt lên môi trường SH thạch rắn, theo dõi mẫu trong 12 tuần và ghi nhận tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ (%), số rễ tơ (rễ/mẫu) và chiều dài rễ tơ (cm).

Để xác định thời gian đồng nuôi cấy thích hợp, các mẫu cây thành ngạnh sau khi chuyển gen được đặt trên môi trường đồng nuôi cấy SH có bổ  sung acetosyringone (AS) 100 µM trong khoảng thời gian khảo sát từ 24-96 giờ, đặt mẫu trong buồng tối, nhiệt độ  25⁰C và ghi nhận tỷ lệ hình thành rễ tơ (%).

2.3. Kiểm tra rễ tơ chuyển gen bằng phương pháp PCR

DNA khuôn của vi khuẩn A. rhizogenes và rễ tơ C. pruniflorum được thu nhận bằng phương pháp CTAB [7]. Tiến hành PCR khuếch đại đoạn gen rolC bằng cặp mồi  rolCF/rolCRvà đoạn gen virD2 với cặp mồi virDF/virDR, kích thước sản phẩm PCR lần lượt là 520 bp và 338 bp. Trình tự primer của gen rolC và gen virD2.

Phản  ứng PCR được thực hiện bằng máy SimpliAmp (ThermoFisher Scientific, Mỹ). Chu kỳ PCR khuếch đại gen rolC gồm: biến tính ở 95°C trong 5 phút, sau đó là 35 chu kỳ ở (1) biến tính 95°C 30 giây; (2) bắt cặp, 54°C, 30 giây; (3) kép dài, 72°C, 60 giây và bước cuối cùng là 72 °C trong 5 phút. Chu trình PCR khuếch đại gen virD2 gồm biến tính ở 94°C trong 5 phút, sau đó là 30 chu kỳ ở (1) biến tính, 94°C, 60 giây; (2) bắt cặp, 62°C, 30 giây; (3) kéo dài, 72°C, 60 giây và và bước cuối cùng là 72°C trong 10 phút. Các sản phẩm PCR được được diên trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Sau đó, được tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trên gel agarose bằng bộ Kit Dneasy Plant Extraction.

2.4. Đánh giá khả năng sinh trưởng của một số dòng rễ

Các dòng rễ tơ có chứa gen rolC được nuôi cấy trên môi trường SH lỏng theo quy trình của Hà Thị Loan và cộng sự [6]. Tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ tơ được đánh giá sau mỗi tháng nuôi cấy và liên tục trong 5 tháng theo các chỉ  tiêu hệ  số  tăng trưởng sinh khối rễ tơ (lần) và khối lượng sinh khối tươi rễ tơ (mg).

Hệ số tăng trưởng sinh khối rễ tơ (lần) = Khối lượng tươi mẫu cấy thu được (mg)/ Khối lượng tươi mẫu cấy ban đầu (mg)

2.5. Thu thập, xử lý số liệu

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần.  Số  liệu thí nghiệm được thu tập, tính toán và xử lý thô trên phần mềm Microsoft Excel 2010 để thu giá trị  trung bình, phân tích Duncan’s test bằng phần mềm  Statgraphics Centurion XV với mức độ tin cậy p ≤ 0,5.

3. Kết luận

Kết quả khảo sát các loại vật liệu chuyển gen (mô lá, cuống lá, đoạn thân in vitro) thông

qua vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834 đã xác định được mô cuống lá và lá in vitro  là vật liệu nhận gen thích hợp cho chuyển gen ở cây thành ngạnh. Lây nhiễm mô lá bởi A. rhizogenesATCC 15834  với mật độ  4.104CFU/mL; nồng độ  AS 100 μM; thời gian nhiễm khuẩn 45 phút, thời gian đồng nuôi cấy 72 giờ  là những điều kiện thích hợp cho quá trình cảm ứng tạo rễ  tơ cây thành ngạnh với tỷ lệ chuyển gen đạt 4,66%. Qua đánh giá và sàng lọc bằng kỹ thuật PCR đã thu nhận được hai dòng rễ tơ có chứa gen rolC (dòng R1 và R2). Dòng R2 sinh trưởng tốt trên môi trường lỏng SH với khối lượng tươi sinh khối đạt 582,08 mg, tăng gấp 2,19 lần so với khối lượng ban đầu. Qua các kết quả  trên cho thấy tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ tóc và sinh khối rễ tạo ra trên các dòng rễ  đối với  thành ngạnh còn thấp hơn so với một số loài thực vật khác chứng tỏ thành ngạnh là một trong những loài khó để  trong việc hình thành và nhân nhanh sinh khối rễ tơ. Cần tiếp tục nghiên cứu chuyển gen với số  lượng lớn hơn và các chủng vi khuẩn khác nhau, thử nghiệm các loại môi trường dinh dưỡng và các dạng môi trường nuôi cấy khác nhau để chọn lọc ra các dòng rễ tối ưu.