Các chất được sử dụng để thay thế sữa có nguồn gốc từ động vật là một dạng chất lỏng được tạo ra từ quá trình phân giải nguyên liệu thực vật (ngũ cốc, giả ngũ cốc, hạt có dầu, quả hạch) thông qua quá trình phân giải từ nước và đồng nhất cho ra kích thước  hạt từ 5–  20 μm mô phỏng sữa bò về hình dáng và độ đặc. Các loại nguyên liệu thay thế sữa có nguồn gốc từ thực vật này mang lại nhiều giá trị dinh dưỡng cũng như lợi ích cho sức khỏe. Hai  chất isoflavones và phytosterol trong sữa đậu nành có tác dụng chống lại các bệnh ung thư, tim mạch, các bệnh về loãng xương, giảm cholesterol; sữa đậu phộng có chứa các hợp chất phenolic giúp chống oxy hóa và các bệnh như bệnh tim mạch vành, đột quỵ và các bệnh ung thư khác; bên trong sữa gạo có chứa phytosterol, đặc biệt là β-sitosterol và γ-oryzanol làm giảm cholesterol, tăng huyết áp, tác dụng chống tiểu đường, chống viêm, chống oxy hóa; acid lauric và vitamin E trong sữa dừa thúc đẩy phát triển trí não, tăng cường hệ miễn dịch, duy trì độ đàn hồi của mạch máu, chống lão hóa và duy trì độ đàn hồi của làn da.

Mặc dù sữa có nguồn gốc thực vật đã có truyền thống từ lâu như các loại sữa đậu, sữa hạt,… tuy nhiên, việc nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ sữa thực vật sẽ thu hút được sự quan tâm nhiều hơn từ phía thị trường người tiêu dùng. Trong đó, sữa chua có  nguồn gốc từ thực vật được xem là một trong những dòng sản phẩm mới phù hợp với sức khỏe của đại đa số người tiêu dùng cũng như mang lại hiệu quả kinh tế cao cho các đơn vị sản xuất nhưng vẫn đảm bảo giá trị dinh dưỡng. Dòng sản phẩm này tương tự như sữa chua thông thường về đặc tính kết cấu và cảm quan cũng như khả năng chứa một lượng lớn các chủng lợi khuẩn có khả năng sinh acid lactic trong thời gian dài bảo quản.

Vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm chịu trách nhiệm lên men các sản phẩm làm từ sữa và đã được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm từ những thế kỷ trước. Nhóm LAB gồm một số loài vi khuẩn như Lactobacillus acidophilus, L. fermentum, L. casei, L. rhamnosus, Streptococcus thermophilus, v.v. Việc ứng dụng LAB trong lên men các loại sữa có nguồn gốc từ thực vật giúp giảm các hương vị không mong muốn do aldehyde, n-hexanol, n -pentanol và n -heptanol, xeton. Quá trình lên men sữa bằng vi khuẩn lactic được quan tâm và nghiên cứu rộng rãi, tuy nhiên việc ứng dụng các chủng vi khuẩn này cho quá trình lên men sữa thực vật ít được chú ý. Kể từ năm 2018 nhiều nghiên cứu tập trung nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ sữa chua thực vật có nguồn gốc từ hạt diêm mạch, đậu xanh, đậu nành, hạt phỉ, đậu phộng, đậu lăng, gạo, dừa, quả hạnh, kiều mạch, v.v.

Nghiên cứu này bước đầu tập trung đánh giá khả năng lên men một số loại sữa có nguồn gốc từ thực vật bằng chủng vi khuẩn Limosilactobacillus fermentum YU2301 nhằm tạo tiền đề cho những nghiên cứu về sau.

1. Vật liệu

Vi khuẩn Limosilactobacillus fermentum YU2301 có mã định danh trên ngân hàng gen NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov): OQ569364, được lưu trữ tại phòng Ứng dụng Vi sinh vật, Trung tâm Thí nghiệm - Thực hành, Trường Đại học Yersin Đà Lạt.Đậu nành, đậu đỏ, đậu phộng, hạt sen, cơm dừa được mua tại các cửa hàng tạp hóa, chợ Đà Lạt.

2. Phương pháp nghiên cứu

2.1. Chuẩn bị sữa thực vật

200g nguyên liệu mỗi loại sau khi rửa qua nước sạch được ngâm với dung dịch NaHCO₃ 0,5% trong 12 giờ, sau đó được rửa sạch với nước cất vô trùng. Nguyên liệu được trộn với

1000 mL nước và đồng nhất bằng máy làm sữa hạt Olivo CB20 ở chế độ làm sữa hạt trong 35 phút. 12% đường ăn tinh luyện được bổ sung vào sau khi vừa hoàn tất quá trình làm sữa hạt. Để loại bỏ vi sinh vật gây bệnh, 500 mL sữa thực vật mỗi loại trong bình thủy tinh 1 lít được thanh trùng ở 95ºC trong 15 phút bằng bể ổn nhiệt (Hãng Memmert, model: WNB14), cuối cùng được làm lạnh đến nhiệt độ phòng ngay lập tức theo mô tả của Li và cs.

2.2. Lên men sữa thực vật

Chủng vi khuẩn L. fermentum YU2301 sau khi lấy ra khỏi tủ đông được hoạt hóa trên canh thang MRS trong 24 giờ ở 37ºC. Sau đó, 1% (v/v) dịch nuôi cấy được sử dụng để nhân sinh  khối  trên môi trường canh thang MRS lắc 150 rpm  bằng máy lắc ấm (Hãng Jinghong, model: THZ-312) ở 37ºC trong 12 giờ.

Để tiến hành lên men  sữa thực vật, dịch nuôi cấy vi khuẩn L. fermentum  YU2301  được

ly tâm với tốc độ 10000 rpm trong 10 phút sau đó được hoạt hóa lại với cùng thể tích ban đầu với dung dịch NaCl 0,85% . 1% và 2% chủng vi khuẩn sau đó  được bổ sung vào sữa thực vật, ủ ở 37ºC. Cứ sau 12, 18 và 24 giờ, các mẫu sữa lên men được sử dụng để phân tích các chỉ tiêu pH, acid lactic, tổng polyphenol, khả năng khử gốc DPPH và mật độ vi khuẩnL. fermentum YU2301.

2.3. Định lượng acid lactic và pH

Giá trị pH được xác định bằng máy đo pH (Hãng Hana, model: Hi2002-02) đã được hiệu chuẩn với pH 4, 7 và 10. Hàm lượng acid lactic tại các thời điểm lên men được xác định dựa theo mô tả của Abraham và cs.: Mười mL mẫu được chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 M sử dụng phenolphtalein làm chất chỉ thị. Quá trình chuẩn độ tiếp tục và đạt đến điểm cuối khi màu chuyển sang hồng. Kết quả được xử lý theo công thức:

Acid Lactic (%) = 𝑉 (𝑁𝑎𝑂𝐻)∗𝑘/ 𝑉(𝑚ẫ𝑢) *100

Trong đó: k là hệ số của acid lactic;  (NaOH): thể tích NaOH dùng để định lượng; V (mẫu): thể tích lượng mẫu đem đi định lượng. Các phép đo pH và TA được lặp lại 3 lần và thực hiện ở 0, 12, 18 và 24 giờ.

2.4. Xác định hàm lượng phenolic tổng

Hàm lượng phenolic tổng trong sữa chua thực vật được xác định theo phương pháp của Singleton  và cs. có hiệu chuẩn. Thêm 0,50 mL dung dịch mẫu đã pha loãng vào 2,5 mL  thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% và phản ứng trong 4 phút trong bóng tối ở nhiệt độ phòng. Sau đó, 2 mL bão hòa dung dịch natri cacbonat 7,5% được thêm vào và sau đó ủ trong bóng tối trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, độ hấp thụ được đánh giá ở bước sóng 765 nm. Cách tiến hành mẫu chuẩn và các mẫu thử là tương tự nhau, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần để tính giá trị trung bình. Acid gallic được sử  dụng như chất đối chứng dương để  xây dựng phương trình đường chuẩn. Hàm lượng polyphenol trong sữa chua thực vật được xác định dựa trên phương trình đường chuẩn acid gallic.

P =𝐶∗𝑉∗𝑑/ 𝑚∗1000

Trong đó: C: nồng độ  acid gallic (𝜇𝑔/mL);  V: Thể tích sữa; d: Hệ số  pha loãng sữa; m: Khối lượng hạt khô trong sữa; 1000: hệ số qui đổi từ 𝜇𝑔 sang mg.

2.2.5. Khả năng loại bỏ gốc oxy hóa

Khả năng kháng oxy hóa của sữa chua thực vật xác định nhờ phương pháp trung hòa gốc tự do 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) của Sharma và Bhat có hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản  ứng gồm 40 µL DPPH 100 µM và 960 µL sữa chua đã  pha loãng. Hỗn hợp phản  ứng được ủ trong tối  ở  nhiệt độ  phòng trong thời gian 30 phút. Sau đó  đo độ  hấp thụquang của DPPH bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 517 nm. Mỗi thí nghiệm tiến hành 3 lần để lấy giá trị trung bình.

2.6. Định lượng mật độ vi khuẩn lactic

Mật độ vi khuẩn lactic được theo dõi trong 24 giờ, các mẫu được thu thập sau 0 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ. Một mililit mẫu được thu thập tại mỗi thời điểm được pha loãng với 9mL dung dịch đệm peptone (Peptone 1 g/L, NaCl 8,5 g/L). Sau khi pha loãng đến nồng độ thích hợp, 100 µL huyền phù được trải lên môi trường thạch MRS bổ sung CaCO₃ sau đó ủ ở 37ºC trong 48 giờ. Các khuẩn lạc có khả năng phân giải CaCO₃ được ghi nhận và tính toán dựa trên đơn vị hình thành khuẩn lạc Log CFU/mL.

2.7. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel. Các thức thử nghiệm được lặp lại ba lần để tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn. Sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu thí nghiệm được xác định bằng phương pháp thống kê ANOVA. Giá trị p < 0,05 được xem là sai khác có ý nghĩa.

3. Kết luận

Chủng vi khuẩn Limosilactobacillus fermentum YU2301 có khả năng lên men một số loại sữa thực vật được làm từ đậu nành, hạt sen, đậu đỏ, đậu phộng, dừa. Sau 24 giờ lên men, độ pH ở tất cả các loại sữa khi được bổ sung vi khuẩn L. fermentum YU2301 với tỷ lệ 1% và 2% (v/v) đều đạt dưới 4,5, đạt thấp nhất với sữa hạt sen; tương tự, hàm lượng acid lactic tăng dần, tại 24 giờ tất cả các loại sữa đều đạt trên 0.3 g/100 mL, đạt cao nhất là sữa hạt sen. Hàm lượng phenolic tổng giảm dần và phần trăm khử gốc DPPH tăng dần theo theo thời gian lên men ở tất cả các loại sữa. Mật độ vi khuẩn L. fermentum  YU2301 tăng dần trong suốt quá trình lên men ở hầu hết các loại sữa, sau 24 giờ mật độ vi khuẩn đều đạt trên 108CFU/ml. Từ các kết quả khảo sát trên cho thấy chủng vi khuẩn  L. fermentum  YU2301 có tiềm năng lên men các sản phẩm thay thế có nguồn gốc động vật. Tuy nhiên, cần có các nghiên cứu sâu hơn để đánh giá tiềm năng lên men ở các giai đoạn tiếp theo cũng như khai thác những đặc điểm có lợi của các loại sữa thực vật lên men.