Phản ứng viêm là một đáp ứng miễn dịch tự nhiên với mục đích bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân ngoại sinh (vi sinh vật, tác nhân cơ, lý, hóa) và nội sinh (bệnh tự miễn, thiếu máu cục bộ, …), ngoài ra phản ứng cũng là một phần của quá trình chữa lành trong các mô bị thương. Quá trình viêm xảy ra dẫn đến hiện tượng thấm mạch, tăng sinh tế bào tại ổ viêm đi cùng với các triệu chứng như sưng, phù nề, nóng, đỏ đau. Đại thực bào - tế bào được biệt hóa bởi các bạch cầu đơn nhân - đóng vai trò quan trọng trong quá trình thanh lọc và kiểm soát sự hình thành mạch cùng tái cấu trúc chất nền ECM (extracellular matrix), kích hoạt con đường tín hiệu viêm qua quá trình chuyển hóa một số yếu tố phiên mã. Song song đó, các đại thực bào đáp ứng quá trình viêm bằng việc sản xuất quá mức các chất trung gian gây viêm như nitric oxide (NO), các dạng oxy phản ứng (ROS), cytokine gây viêm (interleukin 1β, 6) và yếu tố hoại tử khối u (TNFα). Các loại thuốc được sử dụng hỗ trợ việc kháng viêm được chia thành các nhóm phổ biến như thuốc thuộc dòng nacotics, thuốc không thuộc dòng nacotics và corticosteroids. Tuy nhiên, những loại thuốc tổng hợp hóa học đều mang theo các tác dụng phụ không mong muốn, do đó các thuốc có nguồn gốc từ thực vật được đề xuất và phổ biến rộng rãi bởi chứa nhiều các đặc tính an toàn.

Croton oblongifolius Roxb., còn được gọi là cây Cù đèn, thuộc họ Euphorbiaceae, là loại thảo mộc truyền thống được tìm thấy ở nhiều vùng của Thái Lan và các nước Châu Á khác. Lá Cù đèn được sử dụng làm thuốc bổ máu, hỗ trợ tình trạng kém ăn và suy nhược toàn thân. Ngoài ra lá cây còn có hoạt tính kháng khuẩn và sát trùng. Rễ cây vị hơi ngọt, được sử dụng trong các bài thuốc chữa kiết lị. Vỏ cây được dùng điều trị chứng khó tiêu, gan to mãn tính. Quả được dùng để làm giảm các cơn đau bụng kinh và hạt có tác dụng tẩy giun. Trong các bài thuốc y học cổ truyền ở Thái Lan, Cù đèn kết hợp với nhiều loại dược liệu khác điều trị các triệu chứng viêm loét và ung thư dạ dày (kết hợp với Croton sublyratus), cải thiện lưu thông máu, thanh lọc, và làm thuốc giải độc - khi kết hợp cùng Croton stellatopillosus. Một số nghiên cứu công bố về lợi ích sinh học của Cù đèn như chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, và kháng ung thư. Các báo cáo về thành phần hóa học của cây Cù đèn cho thấy, cây chứa nhiều các hợp chất sinh học như tinh dầu (chứa nhiều hợp như sesquiterpenes và diterpenes), polyphenols, saponins, alkaloids, glycosides và flavonoids. Bên cạnh đó, một số hợp chất đã được phân lập từ C. oblongifolius, bao gồm megastigmane glycosides, halimanes, labdane diterpenoids, cembranes, clerodanes, acantoic acid và (-)-ent-kaur-16-en-19-oic acid.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu chứng minh hoạt tính sinh học của cây Cù đèn vẫn chưa nhiều. Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này tập trung đánh giá tác dụng sinh học của các cao chiết với các dung môi khác nhau của thân cành Cù đèn qua hoạt tính chống oxy hóa in vitro và đặc tính kháng viêm in vivo; qua đó cung cấp dữ liệu về nguồn dược liệu tiềm năng trong việc ứng dụng phòng điều trị bệnh.

1. Thiết bị, hóa chất

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Ascorbic acid, Carrageenan và Celecoxib thuộc hãng Sigma, Mỹ. Các dung môi sử dụng đều đạt tiêu chuẩn hóa phân tích, Việt Nam.

Máy đo quang phổ, thiết bị đo thể tích chân chuột (Model 7140) được cung cấp bởi Hãng Ugo Basile (Varese, Italy).

2. Điều chế cao cồn và cao nước của thân cành Cù đèn

Thân cành Cù đèn sau khi xử lý sơ bộ được đem nghiền thành bột (300g), chiết xuất bằng phương pháp hồi lưu với hai loại dung môi chiết là cồn tuyệt đối và nước, tiến hành ở nhiệt độ phòng và thực hiện chiết 03 lần với mỗi dung môi. Dịch chiết được gom lại, lọc cặn và cô đuổi dung môi dưới áp suất kém ở 45°C đến khi đạt được dạng cao đặc. Kết quả thu được hai loại cao tổng tương ứng với hai loại dung môi là cao cồn (ECO) và cao nước (ACO), bảo quản ở 5°C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Hiệu suất chiết thu cao tổng được tính theo công thức dưới đây (1):

H% = Khối lượng cao chiết/ Khối lượng bột nguyên liệu ×100 (1)

3. Khả năng bắt gốc tự do DPPH

Khả năng chống oxy hóa của cao chiết được đánh giá qua việc bắt gốc tự do DPPH và được thực hiện theo phương pháp của tác giả Nguyễn Thị Hằng, có hiệu chỉnh.

Phương pháp được mô tả cụ thể như sau: hỗn hợp gồm 1ml dung dịch DPPH 0.8mM được bổ sung 1ml các mẫu cao chiết ở nồng độ khác nhau. Cao ACO có nồng độ từ 100 đến 500 μg/ml, cao ECO từ 40 đến 320 μg/ml. Các ống nghiệm được ủ trong tối 30 phút ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp đem đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 517nm. Đối chứng dương sử dụng là ascorbic acid với nồng độ khảo sát: 2, 4, 6, 8, 10 μg/ml. Thí nghiệm lặp lại 03 lần.

Khả năng bắt gốc tự do DPPH (I%) được tính toán qua công thức (2):

I (%) = OD₀ – ΔOD/ OD₀ ×100 (2)

Trong đó

OD₀: độ hấp thụ của mẫu trắng

ΔOD: độ hấp thụ của mẫu thử

Kết quả đánh giá khả năng chống oxy hóa của cao chiết được thể hiện qua giá trị IC₅₀ (μg/ml) - nồng độ của mẫu thử mà tại đó có khả năng trung hòa 50% gốc tự do DPPH. Trong đó, giá trị IC₅₀ được nội suy dựa trên phương trình hồi quy tuyến tính của từng loại cao chiết.

4. Khảo sát độc tính cấp đường uống

Chuột Swiss albino đực (05 - 06 tuần tuổi, khối lượng 20 ± 2g) được cung cấp từ Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang. Chuột sau khi nhận về được nuôi ổn định một tuần ở điều kiện môi trường tiêu chuẩn trước khi thử nghiệm.

Thí nghiệm khảo sát độc tính cấp đường uống được thực hiện theo mô hình của tác giả Đỗ Trung Đàm. Chuột được cho nhịn đói 16 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm và chia thành các nhóm tương ứng từng cao chiết ACO và ECO, với mỗi nhóm gồm 05 con.

Lô 1 (lô thử lần 1): cao chiết ACO

Lô 2 (lô thử lần 2): cao chiết ACO

Lô 3 (lô thử lần 1): cao chiết ECO

Lô 4 (lô thử lần 2): cao chiết ECO

Những chuột ở cùng một lô sẽ được cho uống cùng một nồng độ cao chiết duy nhất - liều đậm đặc của mẫu khảo sát có thể bơm qua kim tù cho chuột uống. Thể tích tối đa cho uống trong thử nghiệm là 20 ml/kg trọng lượng chuột và không quá 0.5 ml/chuột/lần. Chuột ở mỗi lô được quan sát riêng lẻ sau khi cho uống 30 phút. Đánh giá, ghi nhận số chuột sống chết và tình trạng lâm sàng chung về độc tính của chuột (hoạt động sinh lý, biểu hiện hành vi, tình trạng da lông, quá trình bài tiết, ...) trong vòng 72 giờ theo dõi. Thí nghiệm được tiếp tục quan sát trong 14 ngày nếu chuột không có dấu hiệu, triệu chứng bất thường hoặc chết sau 72 giờ. Các cơ quan của chuột (gan, tim, thận, lách) được mổ ngay lập tức để đánh giá đại thể và sự thay đổi bệnh lý (nếu có chuột chết) trong giai đoạn theo dõi. Qua đó, giá trị LD₅₀ (g/kg) được xác định dựa theo công thức Karber - Behren. Liều tối đa bơm qua kim không làm chết chuột (Dmax), liều chết tuyệt đối 100% (LD₁₀₀), và liều trung gian (LD₅₀) cũng được xác định. Trong các thử nghiệm dược lý, liều tương đối an toàn (Ds) được tính toán.

5. Khảo sát tác dụng kháng viêm cấp

Thí nghiệm được thực hiện trên mô hình gây viêm phù chân chuột bằng carrageenan để đánh giá tác dụng kháng viêm cấp tính của Cù đèn. Trước khi tiến hành thí nghiệm, thể tích chân chuột bình thường được đo để làm đối chứng. Chuột được tiêm carrageenan 1% dưới da ở gan bàn chân phải để gây phù chân. Mức độ gây viêm tối đa trong khoảng 03 - 05 giờ. Những mẫu cao chiết có tác dụng kháng viêm có biểu hiện làm giảm thể tích phù chân ở chuột.

Những con chuột được tiêm carrageenan có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê về tình trạng phù chân khi so với thể tích chân đối chứng, được đem đi thử nghiệm và chia thành 06 lô, với mỗi liều khảo sát tiến hành trên 08 con chuột.

Lô 1 (lô chứng âm): nước cất

Lô 2 (lô chứng dương): celecoxib liều 0.025 g/kg

Lô 3 (lô thử): cao chiết ACO liều 0.21 g/kg

Lô 4 (lô thử): cao chiết ACO liều 0.42 g/kg

Lô 5 (lô thử): cao chiết ECO liều 0.12 g/kg

Lô 6 (lô thử): cao chiết ECO liều 0.24 g/kg

Để đánh giá mức độ gây viêm, thể tích chân chuột được đo tại các thời điểm 3, 24, 48, 72 giờ sau khi tiêm carrageenan. Thể tích chân được đo lặp lại 02 lần và tính giá trị trung bình. Các lô thí nghiệm vẫn tiếp tục cho uống nước cất, celecoxib và mẫu thử hằng ngày, với thể tích 10 ml/kg trọng lượng chuột.

Mức độ viêm chân chuột (X%) thể hiện qua công thức sau (3):

X (%) = V_S - V₀/ V₀ ×100 (3)

Trong đó

V_s: thể tích chân chuột đo sau khi tiêm carrageenan.

V₀: thể tích chân chuột đo trước khi tiêm carrageenan.

6. Xử lý số liệu

Các số liệu được biểu thị bằng trị số trung bình: M ± SEM (Standard Error of the Mean). Dữ liệu được xử lý thống kê bằng phương pháp ANOVA qua phần mềm SigmaStat - 3.5. Kết quả thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%.

7. Kết luận

Trong cùng điều kiện tách chiết, cao ECO thể hiện khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH mạnh hơn so cùng nghiệm thức ở cao ACO (IC₅₀ lần lượt là 189.25 μg/ml và 272.36 μg/ml). Trong các thực nghiệm in vivo cho thấy ACO và ECO đều không thể hiện độc tính cấp với giá trị D_max tương ứng là 21 g/kg và 23.93 g/kg trọng lượng chuột. Đáng chú ý, trong các nồng độ của các cao chiết, ECO liều 0.24 g/kg thể hiện tác dụng kháng viêm cấp điển hình. Hơn thế nữa, nghiên cứu một phần cho thấy tiềm năng của Cù đèn trong khả năng phát triển các loại thuốc để hỗ trợ, điều trị các bệnh viêm cấp. Kết quả khảo sát là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn của cây Cù đèn trong việc phân tách và đánh giá khả năng của các hợp chất tự nhiên từ cây nhằm ứng dụng vào đời sống thực tiễn.