Tại Việt Nam, bước đầu đã có các nghiên cứu tổng quan về thành phần hóa học hoặc hoạt tính kháng khuẩn của thân và lá cây Rau mương thon. Trên các cơ sở đó, bài báo này nhằm cung cấp thêm thông tin khoa học về hoạt tính sinh học của loài này, thông qua tiến hành sàng lọc tác dụng kháng oxy hóa và ức chế dòng tế bào ung thư gan người HepG2 in vitro của cao nước từ 04 bộ phận dùng (toàn cây, lá, thân và rễ) của Rau mương thon thu hái tại Tây Nam Bộ.  

1. Nguyên liệu

Các bộ phận dùng khác nhau gồm: toàn cây, lá, thân và rễ cây Rau mương thon (Ludwigia hyssopifolia) được thu hái vào tháng 12/2022 tại huyện Thanh Bình, tỉnh Đồng Tháp. Sau khi được làm sạch và loại bỏ lá sâu, dược liệu tươi được cắt nhỏ và tiến hành phơi trong bóng râm đến khô. Mẫu khô được nghiền thành bột (4 kg), sử dụng cho các bước chiết xuất và thử nghiệm sinh học tiếp theo. Ngoài ra, mẫu lá non tươi (50 gram) sau khi thu hái riêng, loại bỏ tạp cơ học, sẽ được bảo quản trong túi nylon đựng mẫu, kèm hút ẩm để phục vụ cho mục đích định danh DNA thực vật.

2. Phương pháp nghiên cứu

2.1. Định danh mẫu bằng giải trình tự ADN thực vật

Thử nghiệm được tiến hành bằng phương pháp khuếch đại một phần vùng gen RbcL và BLAST đối chiếu trên ngân hàng gen NCBI (National Center for Biotechnology Information). ADN của các mẫu được ly trích theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide). Tiếp tục, khuếch đại ADN bằng phản ứng PCR và kiểm tra ADN bằng phương pháp điện di gel agarose. Điện di sản phẩm PCR, tinh chế bằng bộ kit Wizard SV Gel và PCR Clean-up System (Promega), dựa vào sự hiện diện của các băng khuếch đại để nhận diện sự đa dạng giữa các loài. Sau đó giải trình tự bằng phương pháp Sanger với mồi RbcL. Kết quả giải trình tự phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên bản 7.0.5. Dùng phương pháp BLAST trên hệ thống ngân hàng gen NCBI để nhận diện loài.

2.2. Điều chế các mẫu cao chiết khác nhau từ dược liệu Rau mương thon

Mỗi bộ phận dùng (100 gram) của Rau mương thon (toàn cây, lá, thân và rễ) được chiết xuất lần lượt với dung môi là nước cất, ở nhiệt độ chiết là 95⁰C đến kiệt. Gom tất cả các dịch chiết tương ứng, đông khô trên hệ thống Firstek scientific, BFD4.5/50 để loại dung môi nước. Thu được 04 mẫu cao chiết nước tương ứng, ký hiệu lần lượt là TW50, LW50, SW50 và RW50.

Từ đó, các mẫu cao này sẽ được xác định hàm lượng polyphenol toàn phần (TPC), flavonoid toàn phần (TFC), cũng như xác định đặc tính kháng oxy hóa và ức chế dòng tế bào ung thư gan HepG2 trên các mô hình in vitro. Riêng mẫu cao nước toàn cây (TW50) sẽ được định tính để xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật của dược liệu.

2.3. Định tính sơ bộ thành phần hóa học

Định tính mẫu cao nước của toàn cây để xác định alkaloid, flavonoid, coumarin, saponin, tanninoid, polyphenol, acid hữu cơ, đường khử và các polyuronid theo tài liệu tham khảo.

2.4. Xác định hàm lượng polyphenol toàn phần, flavonoid toàn phần

Hàm lượng polyphenol toàn phần

Hàm lượng polyphenol toàn phần được xác định theo phương pháp Folin-Ciocalteu bởi Slinkard và Singleton, Singleton và cộng sự. Lấy 200 μL nước cất được thêm vào 200 μL mẫu. Sau đó được trộn với thuốc thử Folin-Ciocalteu (200 μL). Hỗn hợp này được lắc đều và để yên trong 5 phút. Sau đó, thêm 200 μL natri carbonat (Na₂CO₃) và được ủ hỗn hợp ở 40℃ trong 30 phút. Tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 765 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Acid gallic được sử dụng làm chất chuẩn. Hàm lượng polyphenol toàn phần được tính toán dựa theo phương trình đường chuẩn của acid gallic.

Hàm lượng flavonoid toàn phần

Hàm lượng flavonoid toàn phần được xác định theo phương pháp tạo màu với AlCl3 trong môi trường kiềm bởi Zhishen và cộng sự. Lấy 200 μL nước cất được thêm vào 200 μL mẫu, sau đó được trộn với NaNO₂ (200 μL). Hỗn hợp này được lắc đều và để yên trong 5 phút. Tiếp theo thêm 40 μL AlCl₃. Hỗn hợp được trộn, lắc đều một lần nữa và được ủ trong 6 phút. Sau đó, thêm 400 μL NaOH 1M, 120 μL H₂O trong các đĩa 96 giếng và được đo độ hấp thụở bước sóng 510 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Quercetin được sử dụng làm chất chuẩn. Hàm lượng flavonoid toàn phần được tính toán dựa theo phương trình đường chuẩn quercetin.

2.5. Khảo sát tác dụng kháng oxy hóa in vitro trên thử nghiệm quét gốc tự do DPPH

Thử nghiệm được tiến hành theo Marxen và cộng sự. Mẫu đối chiếu là cao chiết cây Kế sữa Silybum marianum (milk thistle) với thành phần chính là silymarin (chiếm 53,8%).

Trên đĩa 96 giếng, tiến thành hút chính xác lần lượt các thể tích dung dịch mẫu thử hoặc mẫu đối chiếu và methanol. Thêm tiếp 40 μL dung dịch DPPH nồng độ 1000 μg/mL, sao cho nồng độ cuối cùng của mẫu trong giếng tạo thành dãy nồng độ trong khoảng từ 256-8 μg/mL. Trộn đều, để yên hỗn hợp phản ứng ở điều kiện tránh ánh sáng và nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó, đo độ hấp thu quang tại bước sóng 517 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình. Xây dựng phương trình hồi quy để thể hiện mối tương quan giữa phần trăm ức chế gốc tự do DPPH và nồng độ của mẫu. Từ đó, xác định giá trị IC₅₀ của các mẫu thử và mẫu đối chiếu.

2.6. Khảo sát tác dụng gây độc tế bào in vitro trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 bằng phương pháp MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2 - yl )- 2, 5 - diphenyltetrazolium)

Thử nghiệm được tiến hành tại Phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện hóa học. Mẫu đối chiếu là cao chiết Kế sữa (Silybum marianum) với thành phần chính là silymarin (chiếm 53,8%).

Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm tế bào. Tiếp đó, pha tế bào bằng môi trường sạch và điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm (khoảng 1-3x10⁴ tế bào/ml tùy theo từng dòng tế bào). Lấy vào mỗi giếng 10 μl chất thử và 190 μl dung dịch tế bào. Đối chứng dương của thí nghiệm là môi trường có chứa tế bào, đối chứng âm chỉ có môi trường nuôi cấy. Đĩa thí nghiệm được ủ ở điều kiện tiêu chuẩn. Sau 72 giờ mỗi giếng thí nghiệm được tiếp tục ủ với 10 μl MTT (5 mg/ml) trong 4h. Sau khi loại bỏ môi trường, tinh thể formaran được hòa tan bằng 100 μl DMSO 100%. Kết quả được xác định bằng giá trị độ hấp thu quang (OD) đo ở bước sóng 540 nm trên máy quang phổ Biotek. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

3. Kết luận

Nghiên cứu đã định danh loài Ludwigia hyssopifolia thông qua giải trình tự DNA thực vật và xác định được hàm lượng chất chiết của cao nước từ toàn cây, lá, thân và rễ của Rau mương thon. Cao nước có chứa các hợp chất như flavonoid, saponin, tannin, đường khử và polyuronid. Hàm lượng hợp chất phenolic từ lá và toàn cây là cao nhất, cụ thể polyphenol toàn phần là 148,30 ± 0,80 và 136,23 ± 1,00 mg GAE/g; flavonoid toàn phần là 30,34 ± 5,74 và 23,56 ± 8,81 mg QE/g. Toàn cây và lá cũng cho tác dụng kháng oxy hóa cao nhất với IC50 lần lượt là 46,00 ± 0,78 μg/ml và 45,27 ± 0,92 μg/ml. Đối với tác dụng ức chế HepG2, chỉ có cao nước toàn cây cho hoạt tính tiềm năng nhất với IC₅₀ là 176,3 ± 5,12 μg/ml. Do đó, từ những dữ liệu, cao nước từ toàn cây thể hiện tiềm năng nhất đối với cả tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan. Hơn nữa, chưa tìm thấy nhiều công bố liên quan đến tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư gan người HepG2 của cao chiết nước từ Rau mương thon (Ludwigia hyssopifolia) tại Việt Nam, nên các kết quả trên mong muốn góp phần chứng minh tiềm năng của dược liệu trên tác dụng bảo vệ cũng như phòng ngừa bệnh lý liên quan đến ung thư gan.