Enzyme là các protein xúc tác các phản ứng hóa học trong sinh vật sống. Chúng được ứng dụng rộng rãi trong các ngành như sản xuất thực phẩm, chất tẩy rửa, dược phẩm và hóa chất. Tuy nhiên, để sử dụng trong thương mại, các enzyme tự nhiên thường cần được cải thiện về độ ổn định, tính đặc hiệu với cơ chất hoặc hiệu suất xúc tác.

Tiến hóa định hướng là một chiến lược từng đoạt giải Nobel nhằm cải tiến protein. Phương pháp này tạo ra các đột biến nhân tạo trong gen của chúng, sau đó chọn lọc những biến thể vượt trội. Cách tiếp cận này mô phỏng quá trình tiến hóa tự nhiên trong vài tuần thay vì hàng triệu năm.

Một thách thức lớn của phương pháp này là các đột biến nhân tạo có thể tạo ra tới 100 nghìn tỷ biến thể ứng viên, khiến quá trình sàng lọc trở nên cực kỳ tốn thời gian và chi phí.

Để giải quyết vấn đề này, các nhà nghiên cứu tại Đại học Nagoya cùng các cộng sự đã phát triển SMART (Single-Molecule Assay on Ribonucleic acid by Translated product), một nền tảng chọn lọc trong ống nghiệm.

Nghiên cứu của họ cho thấy SMART có thể xác định các biến thể enzyme được cải tiến nhanh hơn nhiều và tiết kiệm chi phí hơn so với các phương pháp truyền thống. Kết quả đã được công bố trên tạp chí ACS Synthetic Biology.

Hệ thống SMART được phát triển bởi nhóm nghiên cứu do Phó Giáo sư Jasmina Damnjanović và Giáo sư Hideo Nakano thuộc Trường Sau đại học Khoa học Nông nghiệp Sinh học của Đại học Nagoya dẫn dắt, phối hợp với các nhà khoa học từ Viện Khoa học Tokyo và Đại học Saitama. Phương pháp này kết hợp thành công kỹ thuật hiển thị mRNA, giải trình tự thế hệ mới và tin sinh học.

Các đặc điểm chính của hệ thống SMART

Thông thường, protein và gen tồn tại tách biệt về mặt vật lý, khiến việc xác định gen nào mã hóa cho một enzyme cụ thể trở nên khó khăn và tốn thời gian.

Trong hệ thống SMART, puromycin đóng vai trò như một “cầu nối” hóa học, liên kết protein enzyme với bản thiết kế tương ứng của nó là RNA thông tin (mRNA). Kỹ thuật hiển thị mRNA này cho phép theo dõi chính xác mối quan hệ giữa từng protein và gen mã hóa của nó ở cấp độ từng phân tử.

Nakano nhấn mạnh: “Về nguyên tắc, không có phương pháp sàng lọc enzyme nào hiệu quả hơn hệ thống này. Việc sàng lọc enzyme ở cấp độ từng phân tử trước đây hiếm khi được thực hiện.”

SMART cũng tích hợp một đơn vị phụ trợ để phát hiện hoạt tính enzyme. Nghiên cứu này sử dụng enzyme phụ trợ APEX2 (ascorbate peroxidase 2 đã được biến đổi) để sàng lọc oxidase. Khi enzyme oxidase mục tiêu hoạt động và giải phóng hydrogen peroxide (H₂O₂), APEX2 sẽ gắn dấu biotin lên các phân tử lân cận, cho phép chúng được tách và thu giữ.

Thí nghiệm sàng lọc enzyme bằng SMART

Các nhà nghiên cứu chọn một enzyme oxidase từ nấm men, SpDAAO, làm mô hình vì nó có tiềm năng lớn trong tổng hợp thuốc và chẩn đoán. Quá trình chọn lọc tập trung vào các D-amino acid làm cơ chất của enzyme do tầm quan trọng ngày càng tăng của chúng trong y học.

Phương pháp SMART bao gồm nhiều bước: tạo thư viện DNA của các biến thể enzyme, tổng hợp enzyme trong ống nghiệm, hình thành thư viện hiển thị mRNA, đánh dấu các enzyme có hoạt tính xúc tác, tách chúng bằng hạt từ và sử dụng dữ liệu giải trình tự để định hướng các vòng chọn lọc tiếp theo.

Để đánh giá phương pháp, nhóm đã thử nghiệm trên một thư viện mô phỏng với các tỷ lệ khác nhau giữa biến thể hoạt động và không hoạt động. Sau một vòng chọn lọc duy nhất, các biến thể hoạt động được làm giàu đáng kể, xác nhận hiệu quả của SMART.

Trong các thí nghiệm thực tế, nhóm đã tạo một thư viện đột biến bằng cách thay thế axit amin thiết yếu ở vị trí 232 bằng mỗi trong số 20 axit amin khác. Phân tích giải trình tự thế hệ mới cho thấy dạng hoang dại (nguyên bản) Y232 được chọn lọc rõ ràng (p < 0,001), củng cố tính chọn lọc của phương pháp.

Ban đầu, phân tích di truyền cho thấy có sự lựa chọn của một số biến thể ngoài dạng nguyên bản. Tuy nhiên, phân tích thống kê sâu hơn xác định rằng đây chỉ là nhiễu thực nghiệm với ý nghĩa thực tiễn rất nhỏ, qua đó củng cố độ đặc hiệu của phương pháp.

Kết luận và triển vọng tương lai

Các thí nghiệm cho thấy phương pháp SMART có hiệu quả rất cao. Đồng thời, nhóm nghiên cứu cũng nhận ra tầm quan trọng của việc phân tích thống kê nghiêm ngặt và thiết kế thí nghiệm cẩn thận, thay vì chỉ dựa vào kết quả ban đầu.

Các nhà khoa học kỳ vọng SMART có thể được áp dụng vượt ra ngoài nhóm enzyme oxidase. Họ hướng tới việc thúc đẩy tích hợp các enzyme mới vào công nghiệp, thiết lập hệ thống này như một nền tảng cho phát triển enzyme trong tương lai và các giải pháp xúc tác sinh học thực tiễn.