I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo tài liệu nguồn lợi thủy sản tỉnh Cần Thơ 1996,  giống tôm càng nước ngọt Macrobrachium tại tỉnh Cần Thơ xuất hiện 8 loài là: Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) tép trứng (M.equiden), tép rong (M. lanchesteri), tép thợ rèn (M. singtangense), tép hột mít (M.mammillodactylus), tép mồng sen (M. mirabile), tép bò (M. idea), tép gạo (M.esculentum)

Từ những đặc điểm phân loại ban đầu cần phải được nghiên cứu về kiểu gene, để có cơ sở khoa học chính xác giúp nghiên cứu ứng dụng trong chọn giống, lai tạo, bảo vệ đa dạng sinh học của cỏc loài tôm càng nước ngọt này. Trong thực tế Macrobrachium rosenbergii De Man, tôm càng xanh (TCX), về kiểu hỡnh cỳ 2 dạng được gọi là TCX (Blue claw) và tôm càng lửa (Orange  claw), nhưng trong định danh phừn loại là một loài. Đừy là loài có giá trị kinh tế cao, cỳ nhu cầu lớn cho xuất khẩu, nhưng sản lượng khai thác tự nhiên sụt giảm nghiêm trọng, đù được sinh sản nhân tạo để cung ứng giống cho người nuôi tôm, nhưng tỷ lệ sống của tôm bột chưa cao chưa ổn định.

II. MỤC TIÊU, PHƯƠNG TIỆN VÀ  PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Mục tiêu

Khảo sát tính đa dạng di truyền protein của tôm càng nước ngọt Macrobrachium, trong đó tập trung giống TCX Macrobrachium rosenbergii nhằm phục vụ trong công tác chọn tạo giống chống lai tạo cận huyết trong sinh sản nhân tạo.

2. Phương tiện

- Vật liệu:

Bảy loài tôm thuộc giống (genus) tôm  Macrobrachium được thu thập từ các chợ trong tỉnh Cần Thơ. Các cá thể tôm dùng làm vật liệu phân tích phải đạt kích thước trưởng thành (adult), có tên khoa học và tên địa phương như sau: Tôm trứng (Macrobrachium equidens), Tép gạo (Macrobrachium esculentum), Tép rong (Macrobrachium lanchesteri ),Tép hột mít (Macrobrachium mammillodactylus), Tép mồng sen (Macrobrachium mirabile), Tép thợ rèn (Macrobrachium sintangense ) và Tôm càng xanh,Tôm càng lửa (Macrobrachium rosenbergii).

Từ loài 1 đến loài 6, mỗi loài được thu thập ngẫu nhiên 50 cá thể từ các chợ trong TP. Cần Thơ. Riêng loài thứ 7 (Macrobrachium rosenbergii), được thu mẫu ở 4 địa điểm là TP. Cần Thơ, huyện Thốt Nốt, huyện Phụng Hiệp và huyện Vị Thanh. Mỗi địa điểm  60 cá thể gồm tôm càng xanh và tôm càng lửa được thu thập ngẫu nhiên. Ngoài ra, thu thập 40 cá thể tôm càng xanh có nguồn gốc nhập khẩu từ tôm bột (Post larvae ) của Thái Lan được nuôi tại Nông trưòng Sông Hậu (huyện Ô Môn, tỉnh Cần Thơ ) trong tháng 9 năm 2000.

- Địa điểm phân tích:

Kỹ thuật điện di protein được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Di truyền Chọn giống, Khoa Nông nghiệp trường Đại học Cần Thơ. Gửi mẫu tôm càng xanh để phân tích acit amin tại Phòng thí nghiệm của Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TP. Hồ Chí Minh.

3. Phương pháp

a) Kỹ thuật điện di

+ Bước 1: ứng dụng quy trình kỹ thuật điện di protein SDS - PAGE (Sodium Dodecyl Sulfat - Polyacrylamid Gel Electrophoresis ) dùng nghiên cứu trên protein dự trữ của đậu nành, có dung dịch ly trích protein như sau: 0.05M Tris-HCl pH 8.5 + 0.1M 2- Mercaptoethanol, 8M Urea trong 100 ml buffer.

+ Bước 2: từ kết quả ở bước một dùng  nghiên cứu trên tôm, hiệu chỉnh dịch ly trích của quy trình ở bước một cho thích hợp với phân tích điện di  protein trên các bộ phận khác nhau của tôm.

- Dụng cụ

Dụng cụ điện di bao gồm bộ nguồn ( power supply), bộ khung slab gel dạng chuẩn (standard gel) và dạng nhỏ (mini gel), máy lắc ( shaker ), máy ly tâm 12.000 vòng/phút, các thiết bị cơ bản khác của Phòng Thí nghiệm Di truyền chọn giống.

- Hoá chất

Hóa chất thí nghiệm gồm các loại cơ bản như tris-base, sodium dodecyl sulfate (SDS), acrylamide, bisacrylamide, 2 - mercaptoethanol, ammonium persulfate, acid acetic, methanol, urea, thuốc nhuộm coomassie brilliant blue R250, bromophenol blue, glycine, triclorur - acetic acid, aceton, tetramethyl-ethylene diamine (TEMED).

- Xác định trọng lượng phân tử (molecular weight)

Dấu protein (protein marker) để xác định  trọng lượng phân tử trong điện di là loại có trọng lượng phân tử thấp LMW (low molecular weight), dùng để xác định những loại protein trong khoảng  94 kDa đến 14,4 kDa. LMW  của Pharmacia Biotech - USA, gồm Phosphorylase b  94 kDa, Albumin 67 kDa, Ovalbumin 43 kDa, Carbonic Anhydrase 30 kDa, Trypsin Inhibitor 20.1 kDa, và a-Lactalbumin 14.4 kDa Xác định khoảng cách di chuyển tương đối R_f của 6 vạch protein chuẩn đã biết  trọng lượng phân tử  trên bản gel để xác định trọng lượng phân tử  của vạch protein cần tìm.

b) Phân tích protein thô và acit amin

- Phân tích protein thô bằng phương pháp Kjeldhal.

- Phân tích acit amin bằng phương pháp "Pico Tag" (Le system Pico Tag pour L' analyse des acid amines) tại Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TP. Hồ Chí Minh: sử dụng cột Pico Tag 3,9 x 150 mm (Waters), đầu dò Gilson UV-vis, bước sóng 254 nm, bơm LC 10Ai (Shimadzu)  kèm bộ trộn dung môi FCV 10AL, máy ghi CR 4A (Shimadzu), nhiệt độ cột 43⁰C, thể tích bơm 20 ml. Riêng acit amin tryptophan được phân tích theo OAOC 45. 4. 04 (1995), P.66; chapter 45.

c) Phương pháp phân tích thống kê.

- Áp dụng phần mềm thống kê Statistica verson 5.5 - năm 2000 để phân tích thống kê, xác định mối quan hệ tiến hóa của 7 loài tôm.

Các kết quả khảo sát trên điện di đồ đối với các vạch protein của từng loài tôm sẽ được ghi nhận là (1) nếu có hiện diện, hoặc (0) nếu không xuất hiện. Xác định  chỉ số tương đồng (Jaccard's similarity index [ S ]) (Sneath and Sokal 1973) cho tất cả các cặp loài theo công thức:

 S = W/ (A + B - W), trong đó W là số vạch protein chung của từng cặp AB, A là số vạch của loài "A", B là số vạch của loài "B". Ma trận tương đồng ( similarity matrix ) được chuyển thành ma trận không tương đồng (dissimilarity matrix ).

  Dissimilarity = 1 - Similarity .

Xây dựng  giản đồ nhánh hay giản đồ răng (dendrogram) với  khoảng cách khác biệt bất kỳ nhiều chiều (Chebychev distance) [distance (x, y ) = Maximum | x_i - y_i | ]; và quy luật liên kết (linkage rules) " trung bình nhóm cặp không đối trọng" (Unweighted pair-group average) được viết tắt  là UPGMA (unweighted pair-group method using arithmetic average ).

- Phân tích hệ số biến thiên (CV) theo công thức:

                           p là tần số vạch protein xuất hiện.

                           q là tần số vạch protein không xuất hiện. q = 1 - p

                          X : trung bình quần thể khảo sát .

III. KẾT QUẢ

   1. Tìm quy trình điện di protein

 - Ứng dụng phương pháp điện di protein bằng kỹ thuật SDS-PAGE nghiên cứu trên râu tôm không làm ảnh hưởng nhiều đến sức khoẻ của vật mẫu sống nên có thể tiếp tục lai tạo, chọn giống đối với những cá thể quý hiếm có thể phát hiện được. Vì vậy chọn râu tôm để làm vật liệu phân tích .

- Protein của râu tôm có sự đa dạng cao nhất so với protein ở các bộ phận khác trên thân tôm như cơ lưng, cơ đuôi, càng hoặc mắt tôm.

- Quy trình điện di protein áp dụng trên râu tôm cần xử lý mẫu thô với TCA (triclorur acetic acid) và dung dịch ly trích mẫu có thành phần như sau: 0.1M Tris HCl pH 8.5  +  1.5 M  2-ME  +  8M Urea  +  0.2% SDS.

 - So sánh tính đa dạng giữa 7 loài tôm của giống Macrobrachium:

Từ kết quả chạy điện di và ghi nhận các vạch protein trên 7 loài tôm của giống Macrobrachium, dựa vào kết quả phân tích hệ số biến thiên (CV) theo từng loài của tất cả 7 loài, nhằm so sánh sự biến động hay đa dạng  giữa các loài với nhau. Nhận xét loài tép trứng có tính đa dạng trong quần đàn tự nhiên thấp nhất (CV = 18,12%), so với các loài bản địa khác đã khảo sát có CV lớn hơn hoặc bằng 24%; tính đa dạng protein trong quần đàn tự nhiên của tép rong và tép thợ rèn là cao hơn (CV 28,76% và 29,85% ). So sánh tính đa dạng protein giữa TCX và tôm càng lửa của cùng loài Macrobrachium rosenbergii cho thấy quần đàn tôm càng lửa tự nhiên có tính đa dạng cao hơn (CV = 33,56%), trội hẳn so với quần đàn TCX (CV = 24,52%). Kết quả phân tích này cho phép nhận xét rằng TCX trong tự nhiên có tính thích nghi với điều kiện của môi trường kém hơn tôm càng lửa.

2. Đặc điểm protein 7 loài tôm Macrobrachium

- Sự tương quan của 7 loài tôm: để tìm hiểu mối tương quan giữa 7 loài tôm, nhất là tôm càng Macrobrachium rosenbergii, qua phân tích nhận thấy 7 loài tôm của giống Macrobrachium ở tỉnh Cần Thơ chia thành 3 nhóm riêng biệt:

+  Nhóm 1: bao gồm các loài tép trứng (1), tép hột mít (4), tép thợ rèn (6), và tép mồng sen (5). Tất cả 4 loài này có đặc điểm sống trong nước ngọt và nước lợ nhạt vùng cửa sông,

+ Nhóm 2: bao gồm 2 loài là tép gạo (2) và  TCX (7L, T, X). Loài (7) và loài (2) có vòng đời  sống trong nước ngọt và nước lợ vùng cửa sông.

+ Nhóm 3: tép rong Macrobrachium lanchesteri là loài chỉ sống trong vùng nước ngọt, khác với 6 loài còn lại có thể sống ở vùng nước ngọt và nước lợ.

- Sự khác biệt protein giữa  TCX, tôm càng lửa, tôm càng nguồn từ Thái Lan của loài  Macrobrachium rosenbergio1: qua phân tích phổ điện di, có khác biệt  một số vạch protein giữa 3 dòng TCX, tôm càng lửa và tôm càng nguồn nhập từ  Thái Lan nuôi tại huyện Ô Môn, tỉnh Cần Thơ khá rõ ở 5 loại protein với trọng lượng phân tử là 42, 40, 35, 34, và 33 kDa.

- Các vạch protein khác biệt ở 3 dòng tôm càng M. rosenbergii. Ở tôm đực hầu như các băng của tôm càng lửa và tôm càng nguồn Thái Lan rất giống nhau. TCX cái có 2 vạch protein 33 kDa và 40 kDa, tôm càng lửa cái không có 2 vạch này nhưng có vạch 35 kDa mà TCX cái không có. Những khác biệt này ở TCX cái và tôm càng lửa cái rất có ý nghĩa trong công tác chọn giống, lai tạo để có thể tạo ra những dòng lai F₁ có ưu thế lai.

3. Định lượng các acid amin của TCX

Kết quả phân tích định lượng mẫu TCX cho thấy TCX có ít  nhất 16 loại acit amin. TCX có đủ 8 loại acit amin không thay thế (essential amino acid) là: Tryptophan 0,70%; Lysine 1,39% Methionin 2,92%; Phenylalanin 8,22%; Threonin 5,48%; Valin 2,41%; Leucin 2,78% và Isoleucin 1,85% nên rất có giá trị về mặt dinh dưỡng.    

III. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ:

1. Kết luận:

Qua nghiên cứu protein trên 7 loài tôm Macrobrachium tại tỉnh Cần Thơ bằng phương pháp điện di SDS-PAGE, có một số kết luận như sau:

- Protein của râu tôm có sự đa dạng cao nhất so với protein ở các bộ phận khác trên thân tôm như cơ lưng, cơ đuôi, càng hoặc mắt tôm.

- Quy trình điện di protein áp dụng trên râu tôm cần xử lý mẫu thô với TCA (Triclorur acetic acid ) và dung dịch ly trích mẫu có thành phần như sau: 0.1M Tris HCl pH 8.5  +  1.5 M  2-ME  +  8M Urea  +  0.2% SDS.

- Bảy loài tôm được phân thành 3 nhóm theo quan hệ như sau:

Nhóm 1: tép trứng, tép hột mít, tép thợ rèn, và tép mồng sen. Nhóm này sống trong nước ngọt và nước lợ, trong đó tép trứng (M. equidens) có tính đa dạng rất thấp, trong điều kiện bất lợi dễ dẫn đến tuyệt chủng; ba loài còn lại mức độ đa dạng còn khá cao, nhất là tép thợ rèn.

Nhóm 2: tép gạo, TCX và tôm càng lửa. Nhóm này có vòng đời trong nước ngọt và nước lợ. Trong đó, tôm càng lửa có mức độ đa dạng cao nhất trong nhóm cũng như trong 7 loài.

Nhóm 3: chỉ một loài tép rong, sống hoàn toàn trong nước ngọt, mức độ đa dạng còn khá cao.

- TCX cái có 2 vạch protein 33 kDa và 40 kDa, tôm càng lửa cái không có 2 vạch này nhưng có vạch 35 kDa mà TCX cái không có.

- Protein thô của TCX chiếm 88,35% vật chất khô, có đủ 8 loại acit amin không thay thế (essential amino acid) với hàm lưọng khá cao.

2. Kiến  nghị

- Tiếp tục nghiên cứu sự khác biệt giữa TCX cái và tôm càng lửa cái ở các vạch protein 33- 40 và 35 kDa bằng các phương tiện công nghệ sinh học khác.

- Nghiên cứu tạo giống lai F₁ từ 3 dạng TCX, tôm càng lửa và tôm càng nguồn Thái Lan để chọn tạo con giống có biểu hiện ưu thế lai ưu việt nhất.

- Nghiên cứu tính đa dạng nguồn tài nguyên di truyền protein các giống loài tôm cá ở đồng bằng sông Cửu Long bằng phương pháp điện di SDS-PAGE.