I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong sản xuất nông nghiệp, giống cây trồng chiếm vị trí rất quan trọng. Ngoài việc nhân giống truyền thống đã được áp dụng từ lâu, hiện nay nhân giống, tạo giống mới bằng những công nghệ mới, nhất là công nghệ sinh học đã đạt nhiều kết qủa đáng kể. Cây công nghiệp dài, ngắn ngày, cây ăn trái, rau màu, nhất là cây lương thực đã được nhiều quốc gia trên thế giới nhân và tạo giống mới bằng phương pháp nuôi cấy mô.

Áp dụng phương pháp nuôi cấy mô với mục tiêu nhân nhanh các giống cây trồng quý, tạo giống mới cho sản xuất trên cơ sở đầu tư ít về thiết bị, xây dựng cơ bản không nhiều, công nghệ không quá khó, đều có thể áp dụng tốt trong cơ quan nhà nước hoặc tư nhân. Tạo giống bằng công nghệ nuôi cấy mô hiện nay chưa là phương pháp quen thuộc cho sản xuất, nhưng nó là công nghệ trong tương lai khi nền nông nghiệp có thói quen sử dụng cây trồng từ nuôi cấy mô. Để góp phần tìm hiểu khả năng ứng dụng công nghệ này đề tài “ Xây dựng phòng nuôi cấy mô thực vật và nuôi cấy mô mía, khoai mỡ “ được tiến hành nhằm tìm ra phương pháp xây dựng phòng nuôi cấy mô, ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô mía và nghiên cứu xây dựng qui trình nuôi cấy mô khoai mỡ.

II. MỤC TIÊU, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

            1. Mục tiêu:

            - Xây dựng phòng nuôi cấy mô thực vật theo một số nguyên tắc cơ bản, trong đó gồm:

                        + Phòng chuẩn bị môi trường, thiết bị cần thiết và vô trùng dụng cụ.

                        + Phòng cấy mô: đảm bảo vô trùng khi cấy

                        + Phòng chiếu sáng nuôi mẫu cấy: đảm bảo vô trùng, ánh sáng, nhiệt đọ, ẩm độ.

            - Tiến hành phương pháp cấy mô trên 2 loại cây mía và khoai mỡ. Đánh giá lại hiệu quả xây dựng phòng nuôi cấy mô.

-          Xây dựng quy trình nuôi cấy mô mía và khoai mỡ.

2. Vật liệu:

a)      Giống mía: giống mía được chọn nuôi cấy mô là giống VN 84 – 200

b)      Giống khoai mỡ:  từ xã Tân Phú Thạnh, huyện Châu Thành , tỉnh Cần thơ. 

3. Phương pháp thực hiện:

- Xây dựng phòng nuôi cấy mô thực vật.

Phòng nuôi cấy mô thực vật xây dựng tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng Cần Thơ gồm:

            + Phòng chuẩn bị môi trường

            + Phòng cấy 

            + Phòng sáng dùng để nuôi dưỡng mẫu sau khi cấy.

-  Nuôi cấy mô mía: nuôi cấy mô mía được thực hiện theo qui trình nuôi cấy mô mía của Viện nghiên cứu lúa ĐBSCL (1998).

- Nuôi cấy mô khoai mỡ: dâm cành " in vitro "

III .KẾT QUẢ

1. Xây dựng phòng Thí nghiệm nuôi cấy mô:

a) Phòng chuẩn bị môi trường dinh dưỡng: thực hiện các công việc như chuẩn bị môi trường, khử trùng các dung dịch nuôi cấy và bảo vệ hoá chất.

+ Các thiết bị chính:

. Máy đo pH, thông thường môi trường pH = 5.8. Sử dụng NaOH 1N và HCL 1N để điều chỉnh pH.

. Lò nung hoặc thiết bị microwave để hoà tan agar trong môi trường, tạo môi trường dinh dưỡng có độ cứng đồng đều

. Cân phân tích, sử dụng đến miligram

. Thiết bị autoclave (nồi hấp tiệt trùng), nhiệt độ đạt 121⁰ C, áp suất 15 psi (pounds per square inch), thời gian hấp 20 phút

            + Nhu cầu dinh dưỡng: la thành phần môi trường rất quan trọng trong quá trình nuôi cấy mô, quyết định sự thành công cho từng vật liệu nuôi cấy. Môi trường MS (Murashige và Skoog) là môi trường cơ bản có bổ sung các hormon tăng trưởng tùy theo mục đích nuôi cấy. Thông thường môi trường nuôi cấy mô chứa các thành phần cơ bản như sau: các muối vô cơ, vitamins, nguồn carbon, bổ sung thành phần hữu cơ  và các hormon tăng trưởng.

b) Phòng cấy:

            Là phòng tiến hành các thao tác nuôi cấy. Phòng này hạn chế tối thiểu sự gây bụi. Trang bị hệ thống đèn cực tím để khử trùng trước khi vào làm việc. Thiết bị của phòng là tủ cấy vô trùng.

c) Phòng sáng nuôi cây:

Phòng chiếu sáng để nuôi mẫu sau khi cấy cũng rất quan trọng, ảnh hưởng đến sự phát triển mẫu cấy, quá trình sinh trưởng của cây con. Cường độ ánh sáng và nhiệt độ rất quan trọng cho sự phát triển của từng loại cây trồng, do đó cần phải được điều chỉnh thích hợp.  Ẩm độ phòng thí nghiệm đạt 60%, nhiệt độ 26^oC.

Các bước thí nghiệm được tóm tắt qua quá trình nuôi cấy như sau:

2. Nuôi cấy mô mía

a)  Chuẩn bị vật liệu

- Đỉnh ngọn, mô lá non được thu từ ruộng mía. Bóc hết bẹ đỉnh ngọn nằm trong khoảng giữa của đốt mấu từ 1- 8. Đỉnh ngọn được cắt ra có chiều dài 1cm và được khử trùng. 03 công thức có thể dùng làm tác nhân khử trùng :

. HgCl₂  0.1%, trong 20 phút

. NaOCl 25%, khử trùng 2 lần , mỗi lần trong 20 phút

. Cồn 70⁰ + HgCl₂ 0.1%, trong 20 phút

- Nuôi cấy mô sẹo: lá non từ đỉnh sinh trưởng

- Nuôi cấy đỉnh ngọn: mô đỉnh của ngọn mía 2-3 tháng tuổi

a) Giai đoạn tạo mô sẹo

- Môi trường tạo mô sẹo mía:

                        . MS + 2 mg/L  2,4D

                        . MS + 2 mg/L  2,4 D + 10% ND

b)      Giai đoạn tái sinh cây

Một tháng sau khi cấy tạo mô sẹo, mô sẹo được chuyển qua môi trường tái sinh cây. Môi trường tái sinh cây gồm: 

                        . MS + BA (1 mg/L) + kinetin (1 mg/L ) + NAA (0.5 mg/L)

                        . MS + BA ( 2.0 mg/L )

c)      Giai đoạn tạo cây từ đỉnh ngọn

Đỉnh ngọn mía sau khi được khử trùng cấy vào môi trường nhân cây từ đỉnh ngọn. Môi trường gồm : MS + BA (2 mg/L ) + NAA (2 mg/L)

d)     Giai đoạn nhân chồi

            Môi trường nhân chồi :

                                    . MS + BA (2 mg/L ) + NAA (0.5 mg/L)

e)      Giai đoạn tạo rễ mía

Cây mía con khoảng 4-5  cm, được tách ra để tạo rễ. Môi trường tạo rễ :  

                             MS + NAA (5 mg/L)

            3. Nuôi cấy  mô khoai mỡ:

     a)  Chuẩn bị vật liệu.

Dây khoai mỡ được chọn từ ngoài đồng, dài 1.5 - 2 m , chỉ lấy từ lóng thứ năm đến lóng thứ mười từ trên đỉnh ngọn. Mục tiêu là để phát triển chồi nách lá từ lóng thân trên môi trường dinh dưỡng.

b)  Giai đoạn tạo chồi từ nách lá

Dây khoai mỡ sau khi được vô trùng, cắt những đoạn mắt ở thân 1-1.5 cm cấy vào môi trường dinh dưỡng. Những đoạn thân được cắt không quá dài để tránh tỉ lệ nhiễm trùng cao.

Môi trường thích hợp phát triển chồi nách :

                                    . MS ( không có chất kích thích sinh trưởng )

                                    . MS + BA (0.1 mg /L)

            c)  Giai đoạn phát triển cây và tạo rễ

Trên môi trường phát triển chồi nách lá. Khi chồi nách phát triển dài, được cắt thành những đoạn ngắn 2-3 cm và cấy vào môi trường phát triển cây.                              

                                    . MS + NAA (0.3 mg/L)

30 ngày sau khi cấy, từ gốc thân xuất hiện thân củ màu tím, màu đặt trưng của giống khoai mỡ và các chồi thân phát triển rất nhiều. Cùng trên môi trường phát triển, rễ xuất hiện và hình thành cây con hoàn chỉnh.   

d)  Giai đoạn huấn luyện cây trong  vườn ươm

Cây con đạt 5-6 cm có thể đưa ra ươm trong nhà lưới. Trong quá trình huấn luyện, cây được đưa ra khỏi phòng sáng nuôi cây và giữ ở nhiệt độ bình thường 28 - 30 ⁰C trong 7 ngày để tập cho cây quen với nhiệt độ. Sau 7 ngày cây được lấy ra khỏi bình và cấy vào chậu hoặc khai có chất nền là tro trấu. Tránh ánh nắng chiếu trực tiếp vào thân cây. Giai đoạn này ẩm độ rất quan trọng. Chú ý không để quá ẩm, chỉ phun tưới nước nhẹ trên thân lá 2 lần / ngày .Với nhiệt độ cao, ẩm độ cao dễ làm cho cây bị thối và chết

IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ:

1. Kết luận:

- Khử trùng là khâu đầu tiên để tạo vật liệu ban đầu để nuôi cấy mô. Việc khử trùng tốt có ý nghĩa quyết định tới các bước tiếp theo. Ba công thức có thể dùng làm tác nhân khử trùng: HgCl₂ 0.1%, NaOCl (3% Na hypochloride).

- Giai đoạn tạo mô sẹo sử dụng chất KTST 2,4D với liều lượng 1, 5 - 2 mg/l.

- Giai đoạn tái sinh cây, tạo cây từ đỉnh ngọn, nhân chồi mía đều sử dụng BA 1 - 2 mg/l , có kết hợp với NAA để tăng hiệu quả tái sinh cây, tạo chồi ngọn và nhân số lượng.

- Tạo rễ mía NAA là một auxin thích hợp, môi trường MS kết hợp với NAA 5 mg/l rễ mía sẽ được hình thành khoảng 25-30 ngày sau khi cấy.    

- Đối với cây khoai mỡ nhân giống qua con đường mô sẹo không có hiệu quả. Trong thí nghiệm này, nhân giống bằng chồi nách lá có kết quả cao. Cành giâm được giâm vào môi trường MS không có chất KTST hoặc kết hợp với BA 0.1 mg/l chồi nách xuất hiện 12 –15 NSKC. Giai đoạn tạo rễ và phát triển cây khi có kết hợp với NAA 0.3 mg/l. 

- Đối với cây mía, công nghệ nhân giống không khó khăn trong kỹ thuật nuôi cấy mô như nhân giống từ đỉnh ngọn, tạo mô sẹo. Việc đưa giống mía bằng nuôi cấy mô vào sản xuất còn quá mới mẽ, cần nhiều công lao động về kỹ thuật, nhất là giai đoạn tạo rễ và giai đoạn huấn luyện cây con thích nghi với môi trường bên ngoài. Nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố xem việc nhân giống mía bằng nuôi cấy mô chỉ là giai đoạn tạo hom giống, chưa đưa được cây giống trồng trực tiếp vào sản xuất.

- Riêng cây khoai mỡ, áp dụng nhân giống bằng chồi nách rất có hiệu quả và thời gian nhân giống nhanh. Cây khoai mỡ được nhân giống bằng lóng thân cho cây tách rời riêng biệt, do đó dễ chọn lọc độ đồng đều khi đưa vào sản xuất.    

2. Đề nghị:

- Bước đầu xây dựng phòng nuôi cấy mô và hoạt động nuôi cấy trên 2 loại cây trồng mía và khoai mỡ đã đạt được một số kết qủa tốt. Cần có chủ trương, kế hoạch cụ thể và đầu tư thêm về hoá chất, thiết bị chuyên dùng nuôi cấy mô.

- Nghiên cứu tiếp tục cây mía nuôi cấy mô khi sử dụng trực tiếp vào sản xuất, không qua giai đoạn làm hom giống. Hướng ứng dụng cây khoai mỡ cấy mô vào sản xuất, hiệu quả và chất lượng so với cây khoai mỡ đang trồng đại trà bằng củ.