Trong khi xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 tiêu chuẩn vàng ngày nay, sử dụng qRT-PCR - phản ứng chuỗi polymerase ngược định lượng (PCR) - cực kỳ nhạy, phát hiện ra một bản sao của RNA trên mỗi microlit, nó đòi hỏi thiết bị chuyên dụng, thời gian chạy vài giờ và một cơ sở thí nghiệm tập trung. Do đó, việc kiểm tra thường mất ít nhất một đến hai ngày.

Một nhóm nghiên cứu tại Đại học California, Berkeley, đang hướng tới phát triển một xét nghiệm chẩn đoán nhanh hơn và dễ triển khai hơn nhiều so với qRT-PCR. Hiện phương pháp đã kết hợp hai loại enzyme CRISPR khác nhau để tạo ra một xét nghiệm có thể phát hiện một lượng nhỏ virus của RNA trong vòng chưa đầy một giờ.

Mặc dù kỹ thuật mới vẫn chưa ở giai đoạn mà nó có thể sánh ngang với độ nhạy của qRT-PCR, có thể phát hiện chỉ một vài bản sao của virus trên mỗi microlit chất lỏng, nhưng nó đã có thể thu nhận lượng virus của RNA - khoảng 30 bản sao trên mỗi microlit - đủ để sử dụng cho khảo sát dân số và hạn chế sự lây lan của bệnh nhiễm trùng.

Nghiên cứu sẽ được công bố trực tuyến trên tạp chí Nature Chemical Biology.

Một số xét nghiệm dựa trên CRISPR đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm cho phép sử dụng trong trường hợp khẩn cấp, nhưng tất cả đều yêu cầu một bước ban đầu trong đó virus của RNA được khuếch đại để tín hiệu phát hiện - liên quan đến việc giải phóng một phân tử huỳnh quang phát sáng dưới ánh sáng xanh - đủ sáng để nhìn thấy. Mặc dù sự khuếch đại ban đầu này làm tăng độ nhạy của thử nghiệm lên mức tương tự như qRT-PCR, nhưng nó cũng giới thiệu các bước khiến thử nghiệm khó thực hiện hơn bên ngoài phòng thí nghiệm.

Nhóm nghiên cứu do UC Berkeley dẫn đầu đã tìm cách đạt được độ nhạy và tốc độ hữu ích mà không phải bỏ qua tính đơn giản của xét nghiệm.

Một nhược điểm khác của quá trình khuếch đại ban đầu là vì nó tạo ra hàng tỷ bản sao virus của RNA, nên có nhiều khả năng lây nhiễm chéo qua các mẫu bệnh nhân hơn. Kỹ thuật mới do nhóm phát triển đã lật tẩy điều này và thay vào đó, tăng cường tín hiệu huỳnh quang, loại bỏ nguồn lây nhiễm chéo chính.

Kỹ thuật không cần khuếch đại, mà họ gọi là Phát hiện Nuclease Tích hợp nhanh Song song (FIND-IT), có thể cho phép các xét nghiệm chẩn đoán nhanh chóng và không tốn kém cho nhiều bệnh truyền nhiễm khác.

Các nhà nghiên cứu hiện đang trong quá trình xây dựng một chẩn đoán như vậy bằng cách sử dụng FIND-IT, bao gồm các bước thu thập và xử lý mẫu và chạy thử nghiệm trên một thiết bị vi lỏng nhỏ gọn.

Để loại bỏ sự khuếch đại mục tiêu khỏi phương trình, nhóm đã sử dụng enzyme CRISPR - Cas13 - để phát hiện đầu tiên virus của RNA và một loại protein Cas khác, có tên gọi là Csm6, để khuếch đại tín hiệu huỳnh quang.

Cas13 là một chiếc kéo đa dụng để cắt RNA; một khi nó liên kết với trình tự đích của nó, được chỉ định bởi một RNA dẫn đường, nó sẽ được mồi để cắt một loạt các phân tử RNA khác. Hoạt động cắt do mục tiêu kích hoạt này có thể được sử dụng để phát hiện một vài chuỗi RNA cụ thể để giải phóng phân tử phóng xạ huỳnh quang. Tuy nhiên, riêng Cas13 có thể cần hàng giờ để tạo ra một tín hiệu có thể phát hiện được khi có lượng RNA mục tiêu rất thấp.

Sử dụng Csm6 để khuếch đại hiệu ứng của Cas13. Csm6 là một enzym CRISPR cảm nhận được sự hiện diện của các vòng nhỏ ARN và được kích hoạt để cắt một loạt các phân tử ARN trong tế bào.

Để tăng cường khả năng phát hiện Cas13, nhóm đã thiết kế một phân tử hoạt hóa được thiết kế đặc biệt có thể bị cắt khi Cas13 phát hiện ra virus của RNA. Một đoạn phân tử này có thể liên kết và kích hoạt Csm6 để cắt và giải phóng một phân tử huỳnh quang sáng từ một đoạn RNA. Thông thường, phân tử chất hoạt hóa nhanh chóng bị phá vỡ bởi Csm6, do đó hạn chế lượng tín hiệu huỳnh quang mà nó có thể tạo ra. Họ đã nghĩ ra một cách để thay đổi chất hoạt hóa về mặt hóa học để nó được bảo vệ khỏi sự suy thoái và có thể siêu nạp Csm6 để liên tục cắt và giải phóng các phân tử huỳnh quang liên kết với RNA. Điều này dẫn đến độ nhạy tốt hơn 100 lần so với chất kích hoạt ban đầu.

Nhóm nghiên cứu cũng đã kết hợp tối ưu các RNA dẫn đường cho phép nhận biết nhạy hơn với virus của RNA bởi Cas13. Khi điều này được kết hợp với Csm6 và chất kích hoạt của nó, nhóm nghiên cứu có thể phát hiện tới 31 bản sao trên mỗi microlit của SARS-CoV-2 RNA trong vòng 20 phút.

Các nhà nghiên cứu cũng thêm RNA chiết xuất từ ​​các mẫu bệnh nhân vào xét nghiệm FIND-IT trong một hộp mực vi lỏng, để xem liệu xét nghiệm này có thể được điều chỉnh để chạy trên thiết bị di động hay không. Sử dụng một thiết bị nhỏ có camera, họ có thể phát hiện SARS-CoV-2 RNA được chiết xuất từ ​​các mẫu bệnh nhân ở một độ nhạy có thể nắm bắt được các trường hợp nhiễm COVID-19 ở mức cao nhất.

Phát triển phương pháp không khuếch đại này để phát hiện RNA là kết quả của việc định hướng lại nghiên cứu trong IGI khi đại dịch bắt đầu hướng tới các vấn đề về chẩn đoán và điều trị COVID-19. Cuối cùng, năm phòng thí nghiệm tại UC Berkeley và hai phòng thí nghiệm thuộc IGI tại UCSF đã tham gia vào dự án nghiên cứu này.

ctngoc