Ảnh minh họa

Phân bón tan chậm kết hợp vi sinh vật là một giải pháp vừa tận dụng được hoạt động có ích của vi sinh vật, vừa góp phần tăng hiệu suất sử dụng phân bón và hạn chế tác động của phân bón tới môi trường (Shaviv, 2001; Trenkel, 2010; Azeem & ctv., 2014). Lân là nguyên tố đa lượng cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển bình thường của cây trồng.

Lân là thành phần cấu tạo của nhiều chất hữu cơ quan trọng trong cây và còn có vai trò tạo môi trường đệm, ảnh hưởng đến khả năng hút các chất khoáng khác của cây. Khi cây được bón đủ lân, cây sẽ sinh trưởng phát triển xanh tốt, khỏe mạnh và đạt năng suất cao (Hoang & ctv., 2004). Tuy lân có nhiều trong môi trường đất nhưng chủ yếu ở dưới dạng không hòa tan nên cây trồng khó hấp thu được. Trong nông nghiệp lân thường được bổ sung vào đất dưới dạng phân lân hóa học nhưng tới hơn 80% lượng phân này bị cố định trong đất bởi các phức hợp kim loại - cation trở thành dạng khó tiêu hoặc bị rửa trôi gây ra những vấn đề về môi trường và làm tăng chi phí trong sản xuất nông nghiệp (Sharpley, 1995; Gyaneshwar & ctv., 2002; Syers & ctv., 2011). Trong tự nhiên, cây trồng muốn hấp thu được các dạng lân khó tan trong đất thường cần có sự hỗ trợ của các vi sinh vật, nhất là các vi khuẩn có khả năng chuyển hóa lân khó tan để tạo ra các dạng lân dễ tan (Bhattacharyya & Jha, 2012). Để hạn chế những tác động bất lợi của phân bón hóa học đối với môi trường và để tăng hiệu suất sử dụng lân thì việc sử dụng các vi sinh vật chuyển hóa lân bổ sung vào trong đất là một trong những giải pháp thân thiện với môi trường và hữu hiệu giúp quản lý sự thiếu hụt lân trong đất nông nghiệp (Sharma & ctv., 2013). Tuy nhiên, khi kết hợp vi sinh vật vào phân bón vô cơ thì độ mặn tạo ra khi phân bị hòa tan là một trong các yếu tố có thể ảnh hưởng và làm chết vi sinh vật (Geisseler & Scow, 2014).  Mẫu đất được thu thập tại Đồng Nai (huyện Nhơn Trạch, Long Khánh), Thành phố Hồ Chí Minh (Thủ Đức, Cần Giờ), Long An. 0,5 kg đất ở tầng mặt có độ sâu từ 2 - 10 cm được cho vào túi nylon sạch, ghi thông tin địa điểm, thời gian thu mẫu. Mẫu được bảo quản trong thùng lạnh khoảng 5oC trong quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu được sử dụng phân lập vi khuẩn ngay hoặc bảo quản trong điều kiện lạnh khoảng 5oC nhưng không quá một tuần.

Cân 10 g mẫu đất thu thập, nghiền nhỏ cho vào bình tam giác chứa 90 mL nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc xoay vòng ở tốc độ 100 vòng/phút, trong 30 phút. Sau đó, pha loãng mẫu ở nồng độ thích hợp. Ở mỗi nồng độ pha loãng, dùng pipet vô trùng hút 0,1 mL mẫu đưa lên môi trường thạch đĩa Pikovskaya (PVK, gồm glucose 10 g, Ca3(PO4)25 g, (NH4)2SO40,5 g, Cl 0,2 g, MgSO4.7H2O 0,1 g, MnSO40,002 g, FeSO40,002g, cao nấm men 0,5 g, agar 20,0 g và nước cất vừa đủ 1000 mL). Dùng que trang trải đều mẫu rồi ủ ở 35oC. Theo dõi sự xuất hiện khuẩn lạc, lựa chọn các khuẩn lạc có xuất hiện vòng phân giải lân. Mỗi khuẩn lạc khác nhau về mặt hình thái được coi là một chủng vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn được tiếp tục làm thuần và bảo quản ở nhiệt độ 5oC. Các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân phân lập được nuôi trên môi trường PVK bổ sung 2%, 3%, 4% NaCl. Chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn được xác định dựa vào vòng phân giải lân bao quanh khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy. Quan sát sự xuất hiện khuẩn lạc có vòng phân giải bao quanh để chọn ra được chủng vi khuẩn vừa có hoạt tính phân giải lân vừa có khả năng chịu mặn.

Các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân và chịu mặn được nuôi trên môi trường PVK. Hoạt tính phân giải lân của vi khuẩn được xác định dựa trên đường kính vòng phân giải và đánh giá bằng hiệu số D - d (mm), với D (mm) là đường kính vòng phân giải, d (mm) là đường kính khuẩn lạc.

Tiến hành nhuộm Gram vi khuẩn, hình thái khuẩn lạc và tế bào được quan sát dưới kính hiển vi. Chủng vi khuẩn được lựa chọn được gửi đi giải trình tự tại công ty Nam Khoa Bioteck (Quận 7, Thành phố Hồ Chí Minh). Kết quả giải trình tự được hiệu chỉnh và tra cứu độ tương đồng nhờ công cụ 16S-based ID trên EzBioCloud và công cụ BLAST trên NCBI. Phân tích quan hệ di truyền bằng phần mềm MEGAX với trình tự các loài vi khuẩn Bacillus hiện có trên Genbank.

Chủng vi khuẩn chuyển hóa lân được lựa chọn từ kết quả phân lập là PSM54 được tăng sinh trong môi trường LB (NaCl 10 g, peptone 10 g, cao nấm men 5 g, H2O đủ 1000 mL) thu sinh khối, tạo dung dịch huyền phù vi khuẩn với mật số 109 tế bào/mL. Chuẩn bị dung dịch sodium alginate 1%, cal-cium chloride 1%, hấp khử trùng ở 120oC trong 30 phút. Trộn dịch huyền phù vi khuẩn thu được với dung dịch sodium alginate đã chuẩn bị tạo hỗn hợp đồng nhất. Cho dung dịch calcium chlo-ride 1% vào cốc, đặt trên máy khuấy rồi cho từ từ dung dịch sodium alginate đã trộn sẵn vi khuẩn cho tới khi đạt được dung dịch đồng nhất thì ngưng khuấy, tiến hành lọc để loại bỏ phần dung dịch calcium chloride.

Phân tan chậm với vỏ bọc có bổ sung vi khuẩn được tạo ra bằng cách cho các viên phân vào thiết bị trống quay với tốc độ quay 450 vòng/phút. Phun dung dịch polyurethane lên bề mặt viên phân với tỷ lệ nhất định. Sản phẩm được sấy khô đến khi đạt khối lượng không đổi, được đưa vào thiết bị vo viên và được trộn đều cùng với chất mang bentonite đã trộn lẫn với các vi hạt sodium alginate có chứa vi khuẩn PSM 54 với tỷ lệ nhất định sao cho mật số vi khuẩn > 109CFU/g, bổ sung polyvinyl alcohol để làm chất kết dính. Sản phẩm được sấy ở nhiệt độ dưới 45oC đến khối lượng không đổi và được đưa vào trống quay để phun phủ lớp polymer tạo bởi carboxyl methyl cellulose - polyvinyl alcohol - glycerol-urea có bổ sung vi hạt chứa vi khuẩn PSM54 và parafin. Sản phẩm sau khi làm khô bề mặt được bảo quản trong bao nylon để tránh hút ẩm.

Kỹ thuật cột rửa trôi dựa trên việc ủ hiếu khí hỗn hợp cát, đất và phân bón tiếp xúc với quá trình rửa trôi không liên tục trong khoảng thời gian xác định được dùng để đánh giá quá trình tan chậm của phân (Sartain & ctv., 2004; Medina & ctv., 2008; Mayer, 2010). Hỗn hợp gồm 90 g đất bề mặt vô trùng trộn với 1.710 g cát thạch anh và 10 g phân bón tan chậm thử nghiệm được cho vào ống nhựa PVC dài 30 cm, đường kính 8 cm có nắp đậy ở trên và van xả ở dưới. Hỗn hợp được giữ lại trong ống PVC nhờ vào một lớp lưới và giấy lọc đặt ở đáy ống. Hỗn hợp được làm ẩm đạt 10% bằng cách thêm 180 mL nước cất. Sau mỗi khoảng thời gian xác định (1, 3, 5, 7, 14, 21, 28, 45, 60, 90 ngày), 500 mL citric acid 0,01% được thêm vào ống để rửa trôi các chất hòa tan có trong hỗn hợp. Dung dịch thu được từ ống PVC được hút ra bằng máy hút chân không. Sau đó lấy một lượng xác định dung dịch thu được đem phân tích hàm lượng nitơ tổng theo TCVN 8557: 2010 và hàm lượng phosphor tổng theo TCVN 8563 : 2010.

Khả năng tồn tại của vi khuẩn trên màng bao phân tan chậm theo thời gian được đánh giá thông qua mật số vi khuẩn trên môi trường PVK. Định kỳ theo thời gian ở thời điểm 0, 7, 14, 21, 28, 45, 60 ngày, cân 10 g phân thử nghiệm cho vào bình tam giác chứa 90 mL dung dịch muối ăn NaCl 0,85%, pH 7 đã khử trùng ở 121oC, trong 30 phút và đặt trên máy lắc vòng với tốc độc 450 vòng/phút cho tới khi lớp màng bao bentonite tan vừa hết, loại bỏ lõi viên phân. Dùng pipet vô trùng hút 0,1 mL dịch thu được cấy vào đĩa petri chứa môi trường PVK đã chuẩn bị, ủ ở nhiệt độ 35oC, xác định mật số vi khuẩn sau 48 giờ và so sánh với mật số vi khuẩn ở mốc thời gian 0 ngày. Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố (CRD), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Số liệu được tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel 2016, phân tích thống kê ANOVA và trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm Minitab 18.

Kết quả định danh dựa vào trình tự 16S-rRNA cho thấy chủng PSM 54 tương đồng 99,9% với Bacillus velezensis. Phân tan chậm được tạo ra nhờ lớp vỏ bọc là các polymer phân hủy sinh học có bổ sung chủng vi khuẩn PSM 54 thỏa mãn tiêu chuẩn về phân tan chậm theo quy định của AAPFCO (Association of American Plant Food Control Officials), (1997). Kết quả khảo sát cho thấy sau 60 ngày được cố định trong màng bao, chủng vi khuẩn PSM 54 vẫn sống và mật số vi khuẩn trên màng bao đạt 88,3% so với mật số ban đầu.