I. ĐẶT VẤN ĐỀ

            Thời gian gần đây ở Việt Nam, các nghiên cứu về công nghệ sinh học (CNSH) trong cải thiện giống cây trồng được thực hiện và mang lại nhiều kết quả khích lệ. Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) đã tạo ra các giống lúa mới bằng phương pháp gây biến dị qua nuôi cấy mô hoặc nuôi cấy bao phấn. Các giống lúa mới này đã được trồng trên diện rộng ở Cần Thơ và khu vực ĐBSCL. Các qui trình nhân giống vô tính các giống cây cảnh, cây ăn quả, cây công nghiệp, cây trồng rừng cũng đã được thực hiện.

Nhằm đáp ứng nhu cầu về sự phát triển các giống lúa ở tỉnh Cần Thơ trong các năm tới theo hướng gia tăng giá trị lúa gạo, trong đó góp phần đáp ứng yêu cầu chất lượng gạo cho xuất khẩu, đáp ứng nhu cầu phát triển cây ăn trái, đặc biệt là nhu cầu về giống và chuẩn bị cho việc chuyển giao các tiến bộ và đào tạo nguồn nhân lực về CNSH cho Cần Thơ, đề tài “Áp dụng công nghệ sinh học trong cải thiến giống cây trồng ở Cần Thơ” đã được thực hiện.

II. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Mục tiêu:

-          Xây dựng qui trình nuôi cấy mô để nhân giống vô tính cây Citrus, đặc biệt là bưởi Năm Roi.

-          Xây dựng qui trình nuôi cấy túi phấn và tạo biến dị soma để tạo chọn các giống lúa được cải thiện về phẩm chất gạo.

-          Xác định qui trình đơn giản để chuyển gen vào các giống lúa Indica bằng phương pháp bắn gen (Particle boombardment) và phương pháp chuyển nạp gen bằng Agrobacterium.

2. Nội dung:

2.1. Nhân giống vô tính bưởi Năm Roi

-         Xác định nguồn vật liệu làm mẫu cấy nhân chồi thích hợp.

-         Xác định các môi trường nuôi cấy thích hợp cho qui trình nhân chồi in vitro.

-         Xác định điều kiện thích hợp cho việc chuyển cây con trong ống nghiệm ra ngoài nhà lưới.

2.2. Nuôi cấy mô lúa tạo biến dị soma và nuôi cấy túi phấn lúa

- Áp dụng qui trình tạo biến dị soma tạo ra các giống lúa có chất lượng được cải thiện.

- Áp dụng qui trình nuôi cấy túi phấn để chọn tạo các dòng lúa phẩm chất tốt từ hạt phấn cây F1.

2.3. Chuyển nạp gen ở lúa

- Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen.

- Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobaterium.

3. Phương pháp nghiên cứu:

3.1. Nhân giống vô tính bưởi Năm Roi:

Qui trình nhân giống vô tính in vitro ở cây bưởi Năm Roi đđược thực hiện theo các bước sau:

- Khử trùng chồi bưởi (chồi đỉnh và chồi bên) còn non và sạch bệnh bằng hóa chất thích hợp. Các mẫu được cấy trên các môi trường khác nhau.

- Tạo cụm chồi trên môi trường căn bản khác nhau.

- Nhân chồi trên môi trường MS+ 0,5 mg/l BA có kết hợp với các vitamine khác nhau thành nhiều chu kỳ.

- Ra rễ các chồi in vitro trên môi trường MS ½ có các auxin khác nhau.

- Thích nghi cây con  trong dung dịch Yoshida và trồng ra đất.

3.2. Nuôi cấy mô lúa tạo biến dị som23a và nuôi cấy túi phấn lúa

- Qui trình tạo biến dị soma: hạt lúa xử lý tiệt trùng được tạo mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l 2,4D. Mô sẹo được cấy chuyền trên môi trường MS có 0,5 mg/l NAA và 2 mg/l Kinetin. Các dòng tái sinh được nhân vô tính trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BAP. Cây tái sinh được tạo rễ trên môi trường MS, thích nghi trong dung dịch Yoshida trước khi được trồng trong nhà lưới. Hạt được thu, trồng và chọn lọc ngoài đồng các thế hệ tiếp theo. Các chỉ tiêu nông học, năng suất, phẩm chất gạo của các dòng lúa từ nuôi cấy túi phấn được đánh giá theo phương pháp IRRI.

- Qui trình nuôi cấy túi phấn: hạt lai F1 được gieo và thu phấn bông lúa non ở giai đoạn cuối đơn nhân, xử lý tiệt trùng, nuôi trên môi trường tạo mô sẹo. Tái sinh trên môi trường MS có bổ sung BAP, NAA. Cây tái sinh được nhân vô tính trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BAP. Cây có bộ rễ phát triển được thích nghi trong dung dịch Yoshida ở nhiệt độ phòng trước khi cấy, quan sát trong nhà lưới. Các chỉ tiêu nông học, năng suất, phẩm chất gạo của các dòng lúa được đánh giá theo phương pháp IRRI.

3.3. Chuyển nạp gen ở lúa

- Chuyển nạp gen gián tiếp nhờ Agrobaterium: dòng vi khuẩn A. tumefaciens LBA 4404 mang plasmid pTOK 233 nhận từ công ty Thuốc lá Nhật được dùng chuyển nạp gen vào phôi non, mô sẹo từ hạt gạo giống được trắc nghiệm sự biểu hiện gen gus. Mô sẹo được nuôi cấy, tái sinh, tạo rễ, chuyển trồng trong nhà kính cho các phân tích tiếp theo.

- Chuyển nạp gen bằng súng bắn gen: DNA ly trích và pha loãng từ dòng E. coli mang plasmid pWG 1515-gusA-hpt được dùng cho qui trình bắn gen. DNA được tẩm trên các hạt vi đạn bằng vàng có kích thước 0,1µ, dùng máy bắn gen Biolistic PDS- 1000 He bắn vào mô sẹo đã cấy sau 4 giờ với khoảng cách và áp lực bắn khác nhau. Mô sẹo được trắc nghiệm sự biểu hiện gen gus; nuôi cấy, tái sinh, tạo rễ, chuyển trồng trong nhà kính cho các phân tích tiếp theo.

III. KẾT QUẢ

1. Nhân giống vô tính bưởi Năm Roi:

            Khử trùng tốt nhất bằng cách lắc với cồn 70⁰ (2 phút), khử trùng với HgCl₂ 0,1% trong 30 phút, với Streptomycine 50 mg/l trong 40 phút và rửa với nước cất vô trùng 3 lần. Hiệu quả vô trùng đạt được 50- 60%, tỉ lệ mẫu sống 30- 50%.

            Tạo cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS+0,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l thiamine, đạt 3,9 chồi/mẫu cấy từ chồi bên và 2,2 chồi/mẫu cấy từ chồi đỉnh.

            Nhân chồi thích hợp nhất trên môi trường MS+0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA, hệ số chồi 3- 4 chồi/mẫu với chiều cao 5- 6 cm. Các chồi từ cụm chồi có thể nhân 5- 8 chu kỳ mà vẫn cho ra rễ bình thường.

            Ra rễ cây Citrus rất khó so với cây thân thảo. Môi trường thích hợp có thể là MS ½ đa lượng + 0,2 mg/l NAA, cho ra 2- 3 rễ/cây, dài 3- 4 cm/3 tuần nuôi cấy. Cây con có thể đưa ra trồng nhà lưới.

            Cây con được chuyển từ môi trường ra rễ sang dung dịch thích nghi Yoshida 50% trong 10 ngày, chuyển qua đất mùn xốp có tưới Yoshida 50% trong 10 ngày và đặt cây trong điều kiện bóng râm, có độ ẩm cao là tốt nhất.

2. Nuôi cấy mô lúa tạo biến dị soma và nuôi cấy túi phấn lúa

-  Kết quả tạo biến dị soma nuôi cấy mô

            Tạo được 747 dòng cá thể tái sinh, thu được 348 dòng thế hệ thứ nhất và tạo ra 257 dòng lúa. OM 3405 (Pant 4) thể hiện ưu điểm vượt trội là giống cực sớm, lý tưởng cho việc né lũ trong vụ Hè Thu, tránh mặn cho vụ Đông Xuân, được bình chọn trong Top 10. Giống NTCĐ ĐB (Nàng Thơm Chợ Đào) vẫn còn giữ được mùi thơm, có dạng hình rất đẹp, được nông dân bình chọn trong Top 10 giống đẹp nhất. Nhìn chung, một số dòng vừa thể hiện các đặc tính ưu việt của giống gốc và có thêm các đặc tính cần cải thiện.

-  Kết quả nuôi cấy túi phấn:

            Khoảng 5.000 túi phấn được cô lập và nuôi cấy cho mỗi tổ hợp, 318 dòng lúa từ nuôi cấy túi phấn của các tổ hợp trên được tạo ra và được đánh giá ở nhà lưới, ruộng thí nghiệm. Các dòng trên thể hiện từ mức kháng đến kháng trung bình đối với rầy nâu, kháng trung bình với đạo ôn. Có đặc tính nông học tốt. Hạt thon dài 6,7- 7,2 mm; mềm cơm, hàm lượng amylose trung bình, 30 dòng có mùi thơm.

3. Chuyển nạp gen ở lúa:

-  Kết quả chuyển nạp gen bằng Agrobacterium tumefaciens:

            Sự biểu hiện tạm thời của phản ứng gen gus thể hiện plasmid đã chuyển vào tế bào chủng với A. tumefaciens. Qua 3 lần thử nghiệm, tỉ lệ mô sẹo có phản ứng GUS khác nhau tùy giống nhưng còn thấp, khoảng 2- 8% trên các giống Indica so với giống Japonica đối chứng là 22,7 - 38,2%. Tuy nhiên, trắc nghiệm sự biểu hiện GUS trên lá các dòng tái sinh đạt dương tính thấp, có thể do các dòng thoát thanh lọc, hoặc đoạn DNA được chuyển bị loại trừ khỏi tế bào trong quá trình phân hóa, phân chia.

-  Kết quả chuyển nạp gen bằng súng bắn gen:

            Kết quả cho thấy, khi bắn ở khoảng cách rack1-3 với áp lực 900 và 1.000 psi cho kết quả tốt. Tỉ lệ mô sẹo có phản ứng GUS tạm thời khác nhau tùy giống, nhưng giống Indica thấp hơn giống Japonica.

IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận:

- Qui trình nhân giống vô tính bưởi Năm Roi in vitro có thể được thực hiện thông qua 5 bước như sau: (i) khử trùng, (ii) tạo cụm chồi, (iii) nhân chồi, (iv) ra rễ và (v) thích nghi, trồng ra nhà lưới. Trong đó:

§   Nhân giống vô tính từ chồi bên tốt hơn chồi đỉnh.

§    Nhân chồi thích hợp nhất trên môi trường MT hoặc MS có 0,5 mg/l BAP. Ra rễ tốt trên môi trường MS ½ có 0,2 mg/l NAA. Thích nghi cây con trong dung dịch Yoshida 50% (10 ngày), được trồng trên nền đất bùn xốp có hoặc không tưới dung dịch Yoshida.

- Các dòng lúa triển vọng thông qua tạo biến dị soma là OM 3405-1, NTCĐĐB, OM 3407, OM 3566-15 với các đặc điểm chín sớm (86-102 ngày), năng suất cao, chống chịu rầy nâu, trong đó OM3566-15 có mùi thơm. Các dòng lúa triển vọng thông qua nuôi cấy túi phấn là OM 3394, OM 3455 và OM 3688 có đặc điểm chín sớm (90- 95 ngày), dạng hình đẹp, phẩm chất gạo ngon, có mùi thơm.

- Bước đầu có thể áp dụng chuyển nạp gen lúa bằng Agrobacterium tumefaciens và bằng súng bắn gen.

2. Kiến nghị:

- Có thể áp dụng qui trình nhân giống bưởi Năm Roi bằng phương pháp nuôi cấy mô đã được xác định trong đề tài.

- Có thể áp dụng qui trình nuôi cấy túi phấn và tạo biến dị soma cho cây lúa.

- Chuyển nạp gen lúabằng Agrobacterium tumefaciens và bằng súng bắn gen trong đề tài chỉ là bước đầu trong nghiên cứu cơ bản, có giá trị về mặt khoa học và đào tạo.

- Các công trình đã thực hiện trên cần có những nghiên cứu tiếp theo nhằm cải tiến qui trình nuôi cấy mô cây bưởi, tạo biến dị và chuyển nạp gen trên cây lúa.