Bạch cầu đa nhân trung tính đóng một vai trò quan trọng trong việc bắt đầu quá trình viêm với các phân tử khác có tên là chất trung gian gây viêm được giải phóng bởi một số tế bào như cytokine, endotoxin, leukotrien, prostaglandin và các loại oxi phản ứng (Reactive Oxigen Species, ROS). Đồng thời, sự gia tăng ROS quá mức sẽ dẫn đến stress oxi hóa (là hệ quả của sự cân bằng chênh lệch giữa sản xuất ROS và chất kháng oxi hóa trong cơ thể sinh vật). Sự gia tăng của ROS làm tăng tính nghiêm trọng của nhiều bệnh tật như ung thư, tổn thương gan, đái tháo đường, hình thành đục thủy tinh thể và bệnh Alzheimer. Cơ thể sinh vật có khả năng điều hòa hàm lượng ROS nhờ vào các enzyme kháng oxi hóa, bao gồm superoxide eff utase (SOD), catalase (CAT) và glutathione peroxidase (GPx) trong các mô. Tuy nhiên, hệ thống kháng oxi hóa tế bào nếu bị lỗi sẽ khiến các sinh vật phát triển một loạt các bệnh liên quan đến viêm hoặc ác tính. Như vậy giữa ROS và viêm có mới liên hệ mật thiết với nhau. Chính vì vậy, mà nghiên cứu này tập trung đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa và kháng viêm nhằm làm cơ sở ban đầu cho các nghiên cứu chuyên sâu về thực phẩm chức năng có tác dụng điều trị các bệnh do viêm và ngăn ngừa oxi hóa. Hiện nay, con người dần có xu hướng ưa chuộng các sản phẩm dược liệu từ thiên nhiên. Bởi lẽ, các chất kháng oxi hóa tự nhiên trong thực vật là những chất kháng viêm tiềm năng và đang thu hút sự chú ý trong những năm gần đây.

Rau ngổ (Enydra fluctuans Lour.) là một loại cây thân thảo được xem là một loại thức ăn dân dã nhưng bên cạnh đó cũng là một vị thuốc trong dân gian có tính giải độc và điều trị một số bệnh như viêm, bệnh về da, thủy đậu. Trên thế giới, hiện nay cũng có một số công trình khoa học công bố về những công dụng nổi bật của rau ngổ. Một số nghiên cứu về hoạt tính sinh học cho thấy cây rau ngổ có tính kháng sinh, bảo vệ gan, kháng oxi hóa, hạ huyết áp, giảm đau và kháng tiêu chảy. Bên cạnh đó, các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy trong cây rau ngổ có chứa gibberelin, các dẫn xuất cholesterol, cocquiterpene, D-limonen, phytol, ceramide, beta-sitosterol-3-O-b-D-glucopyranoside. Tại Việt Nam, việc khảo sát thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học trên cao ethanol của loài cây này chưa có nhiều nghiên cứu. Vì vậy, việc định tính và định lượng thành phần hóa học cũng như xác định một số hoạt tính kháng oxi hóa và kháng viêm của cây rau ngổ để bổ sung cơ sở khoa học về nguồn dược liệu triển vọng tạo ra các sản phẩm phòng ngừa và điều trị một số bệnh ở người.

1. Nguyên liệu

Phần trên mặt đất của cây rau ngổ khoảng 45 ngày tuổi được thu tại thành phố Cao Lãnh, Đồng Tháp. Mẫu thực vật được định danh dựa trên các đặc điểm mô tả hình thái theo bộ sách Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ.

2. Hóa chất

Dung môi: ethanol (Việt Nam), Folin- Ciocalteu (Sigma), sodium carbonate (Trung Quốc), gallic acid (Trung Quốc), sodium nitrite (Trung Quốc), aluminium chlohydride hexa hydrate (Trung Quốc), sodium hydroxide (Trung Quốc), quercetin (Trung Quốc), ABTS- 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) (Merck), kali persulfate (Merck), trolox (Merck), potassium ferricyanide (Merck), trichloroacetic acid (Merck), iron (III) chlorid (Merck), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)(Sigma), albumin huyết thanh bò (Himadia) diclofenac (Himadia) và một số hóa chất khác.

3. Phương pháp nghiên cứu

3.1. Điều chế cao ethanol của phần trên mặt đất cây rau ngổ

Phần trên mặt đất của cây rau ngổ được loại bỏ phần hư, rửa sạch, để ráo nước và phơi khô tự nhiên. Sau đó, mẫu được cắt thành từng khúc nhỏ và xay nhuyễn để dùng cho quá trình nghiên cứu. Mẫu (2 kg) được ngâm dầm trong ethanol (2 L) mỗi lần 24 giờ, sau 3 lần thì mẫu đã được chiết kiệt. Dịch ngâm được lọc qua giấy lọc và tiến hành cô đuổi dung môi thu được cao chiết ethanol phần trên mặt đất cây rau ngổ (22 g) có mùi khẳng, màu xanh đậm, dạng rắn.

3.2. Định tính thành phần hóa học của phần trên mặt đất cây rau ngổ

Thành phần hóa học của cao ethanol phần trên mặt đất cây rau ngổ gồm: alkaloid, flavonoid, glycoside, tannin, steroid, saponin được định tính sơ bộ bằng các phương pháp định tính các nhóm hợp chất thiên nhiên.

3.3. Định lượng polyphenol và flavonoid toàn phần trong cao tổng ethanol

Định lượng polyphenol tổng bằng thuốc thử Folin-Ciocalteu

Hàm lượng polyphenol được xác định theo phương pháp của Singleton và cs. có hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng gồm 250 μL cao chiết trong 250 μL nước và 250 μL thuốc thử Folin-Ciocalteu, lắc đều. Sau đó, thêm vào 250 μL Na₂CO₃ 10% rồi ủ 30 phút ở 40⁰C trong bể điều nhiệt. Độ hấp thu quang phổ của hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 765 nm. Gallic acid được sử dụng như chất chuẩ n để xây dựng phương trình đường chuẩn. Hàm lượng polyphenol trong cao ethanol phần trên mặt đất cây rau ngổ được xác định dựa trên phương trình đường chuẩn gallic acid.

Phương pháp định lượng flavonoid

Hàm lượng flavonoid được xác định bằng phương pháp so màu AlCl₃ của Bag và cs. có hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng gồm 1 mL cao chiết ở nồng độ khảo sát pha trong 1 mL nước cất rồi lắc đều. Sau đó, hỗn hợp phản ứng được thêm vào 200 μL NaNO₂ 5%, để yên 5 phút tiếp tục thêm 200 μL AlCl₃ 10%, lắc đều. Hỗn hợp phản ứng sau khi ủ 6 phút được thêm 2 mL NaOH 1M. Cuối cùng nước được thêm vào cho đủ 5 mL và đo độ hấp thu quang phổ ở bước song 510 nm. Quercetin được sử dụng như chất đối chứng dương. Hàm lượng fl avonoid toàn phần trong cao ethanol phần trên mặt đất cây rau ngổ được xác định dựa vào phương trình đường chuẩn Quercetin.

3.4. Khảo sát hoạt động kháng oxi hóa của cao ethanol phần trên mặt đất cây rau ngổ

Khảo sát hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH (2, 2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl)

Khả năng kháng oxi hóa của cao ethanol phần trên mặt đất cây rau ngổ được xác định nhờ phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH có hiệu chỉnh được tóm tắt như sau:

Hỗn hợp phản ứng gồm 40 μL DPPH (1000 μg/mL) và 960 μL cao chiết. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong tối 30⁰C trong thời gian 30 phút. Sau đó, đo độ hấp thu quang phổ của DPPH ở bước song 517 nm. Tinh chất trolox được sử dụng như chất đối chứng dương.

Khảo sát hiệu quả trung hòa gốc tự do ABTS^•+ (2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulfonic acid))

Hoạt tính kháng oxi hóa được xác định bằng phương pháp khử màu ABTS^•+ tóm tắt như sau: ABTS^•+ được tạo ra bởi phản ứng ABTS 7 mM với 2,45 mM kali persulfate. Hỗn hợp được ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng 12-16 giờ trước khi sử dụng. Sau đó, hỗn hợp được pha loãng và đo mật độ quang ở bước sóng 734 nm là 0,70±005. Tiến hành khảo sát bằng cách cho 10 μL cao chiết phản ứng với 990 μL ABTS•+ ở nhiệt độ phòng trong 6 phút.

Sau đó, hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 734 nm. Tinh chất trolox được sử dụng như đối chứng dương.

Khảo sát hiệu quả kháng oxi hóa của phần trên mặt đất cây rau ngổ dựa trên hoạt động khử sắt

Hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethanol phần trên mặt đất cây rau ngổ được xác định dựa trên khả năng khử Fe³⁺ trong phức Fe(CN₆)^3- thành Fe²⁺ trong phức Fe(CN₆)^4- khi có mặt của chất kháng oxi hóa, sau đó phức Fe(CN₆)^4- tiếp tục phản ứng với Fe³⁺ trong FeCl₃ để tạo thành phức Fe[Fe(CN₆)]- có màu xanh được đo ở bước sóng 700 nm. Khả năng khử sắt của cao chiết được thực hiện theo phương pháp của Oyaizu. Hỗn hợp phản ứng lần lượt gồm 500 μL cao chiết, 500 μL đệm phosphate (0,2 M, pH=6,6) và 500 μL K₃Fe(CN)₆ 1%. Sau khi hỗn hợp phản ứng được ủ ở 50⁰C trong 20 phút, thêm 500 μL CCl₃COOH 10% rồi ly tâm 3000 vòng/ phút trong 10 phút. Phần dịch sau khi ly tâm được rút 500 μL cho vào 500 μL nước và 100 μL FeCl₃ 0,1%, lắc đều. Độ hấp thu quang phổ của hỗn hợp phản ứng được đo ở bước song 700 nm. Tinh chất trolox được sử dụng như đối chứng dương.

Hoạt tính kháng oxi hóa của cao chiết phần trên mặt đất cây rau ngổ được đánh giá thông qua hàm lượng chất kháng oxi hóa tương đương μg/ mL trolox và giá trị IC₅₀ (OD_0,5) dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính của tinh chất trolox và cao chiết theo mô tả của Piaru và cs.

Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro củacao chiết

Khả năng kháng viêm của cao chiết được khảo sát thông qua hoạt động ức chế sự biến tính protein được thực hiện theo phương pháp của Shah và cs. có hiệu chỉnh như sau: Hỗn hợp phản ứng gồm 150 μL cao chiết với 150 μL dung dịch albumin huyết thanh bò (BSA) 5%. Sau đó, hỗn hợp được ủ ở 27⁰C trong 15 phút. Sự biến tính protein được gây ra bằng cách giữ hỗn hợp phản ứng ở 60⁰C trong 10 phút. Sau khi làm mát, tiến hành đo mật độ quang tại bước song 660 nm. Diclofenac được sử dụng như đối chứng dương. Khả năng ức chế sự biến tính protein được xác định theo công thức sau: Phần trăm ức chế (%)=100 (1-Vt/Vc). Trong đó, Vt: mật độ quang của mẫu thử có chứa cao chiết hoặc chất chuẩn, Vc: mật độ quang của mẫu chứa đệm phosphate. Đồng thời, cao chiết và diclofenac cũng được xác định giá trị IC₅₀ dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính.

3.5. Phân tích và xử lý số liệu

Tất cả các phép thử nghiệm được thực hiện ba lần và kết quả được biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Các kết quả được phân tích sâu hơn bằng ANOVA (thử nghiệm Fisher) sử dụng phần mềm Minitab 16.0. Kết quả được coi là có ý nghĩa thống kê với p<0,05.

4. Kết luận

Kết quả cho thấy, phầ n trên mặ t đấ t cây rau ngổ có khả năng trung hòa gốc tự do DPPH, ABTS^•+ và năng lực khử RP tương ứng với giá trị IC₅₀ lần lượt là 53,36±0,68, 66,36±1,47 và 74,17±2,27 μg/mL. Bên cạ nh đó, cao ethanol của phần trên mặt đất cây rau ngổ có hoạt tính kháng viêm in vitro với giá trị IC₅₀=66,19±3,10 μg/mL. Thành phần hóa học phần trên mặt đất cây rau ngổ gồm alkaloid, flavonoid, steroid, tannin và glycoside. Hàm lượng flavonoid và polyphenol trong cao chiết phần trên mặt đất cây rau ngổ đã được xác định cho giá trị lần lượt là 16,73±1,37 mg GAE/g và 138,30±1,89 mg QE/g cao chiết. Riêng hợp chất saponin thì không phát hiện ở cây. Điều này cho thấy, phần trên mặt đất cây rau ngổ sẽ có nhiều tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực dược liệu về hợp chất kháng oxi hóa hỗ trợ điều trị các bệnh có nguyên nhân từ stress oxi hóa và viêm.